miR-145-3p在多發性骨髓瘤中表達及其對多發性骨髓瘤細胞凋亡與自噬作用機制的研究

任明亮，李 輝，劉冬斌，陳國雄，譚鎮南，劉 鵠

(南方醫科大學附屬南海醫院骨科，廣東 佛山 528000)

多發性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)為一種漿細胞系惡性腫瘤，目前尚無完全治愈方法，分析MM的發病機制可為靶向藥物的研發提供依據[1]。微小RNA(miRNA)是一種非編碼的RNAs，可同靶mRNA的3’端非翻譯區(3’UTR)互補結合抑制mRNA翻譯或降解mRNA鏈，因此miRNA可能通過影響mRNA翻譯過程而影響細胞多種功能，近期有研究顯示miR-21、miR-32、miR-19a和miR-92a參與MM發生發展[2，3]。而miR-145、miR-145-3p也是miRNA家族成員之一，被認為是腫瘤抑制基因，可靶向調控多個腫瘤相關基因，繼而影響腫瘤生長、侵襲、轉移及腫瘤血管生成，已有研究證實miR-145與急性髓系白血病、骨髓間充質干細胞成骨發生密切相關，但miR-145-3p對MM的調控機制研究較少[4，5]。本文分析了miR-145-3p在MM中表達情況及其靶向調控P21/ULK1/LAMP2信號通路對MM細胞的凋亡與自噬作用，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料2014年6月至2017年5月我院收治的MM患者60例(MM組)、健康體檢者30例(正常組)，納入標準：①MM患者符合《中國多發性骨髓瘤診治指南(2013年修訂)》[6]中相關診斷標準，經組織活檢或骨髓涂片、單克隆抗體免疫球蛋白、X射線檢查確診；②MM患者漿細胞在10%～30%；③均知情同意本研究并簽署知情同意書，且正常組無心、肝、腎等重要臟器疾病。MM組男33例，女27例；年齡20～54歲[(37.15±4.03)歲]，正常組男14例，女16例；年齡21～52歲[(37.12±4.05)歲]，兩組一般資料比較差異無統計學意義(P> 0.05)，有可比性。

1.2方法

1.2.1miRNA提取及細胞株來源 所有入組患者均進行骨髓穿刺，留取新鮮血漿2～4 ml，采集血液樣本均置于血常規EDTA-K2抗凝管，后采用QIAGEN試劑盒以Trizol法抽提miRNA，并取2 μl在核酸蛋白定量測定儀上測定OD值，進行鑒定與準確定量。MM細胞株U266、RPMI-8266、LP-1、H929(各30株)，均由本院血液科提供，經MACS分選CD138+漿細胞作為正常對照組細胞。

1.2.2逆轉錄及引物設計與合成 按TaKaRa公司試劑盒COde NO.RR718提供說明書進行，20 μl混合反應液包括：dNTP 2 μl，10X RT Buffer 2 μl，RT特異引物(1 μm)0.3 μl，Total RNA 100 ng，MMLV反轉錄酶(200 U/μl)0.2 μl，RNA酶抑制劑(40 U/μl)0.3 μl，RNase Free dH2O補足至20 μl，逆轉錄條件：16 ℃ 30 min；42 ℃ 40 min；85 ℃ 5 min。

1.2.3熒光定量PCR反應 以熒光定量PCR法(ABI7900實時熒光PCR儀，購自美國Applied Biosystems公司)檢測miR-145-3p水平，反應體系：2×Master Mix 5 μl，cDNA 2 μl，10 uM的PCR特異引物F 0.5 μl，10 μm的PCR特異引物R 0.5 μl，以RNase Free dH2O補足至10 μl，反應條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，循環40次；95 ℃ 10 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。

1.2.4細胞轉染實驗 ①選取毒性最低的人骨髓瘤細胞株LP-1(30株)，在37 ℃、5%二氧化碳培養箱中，加10%胎牛血清、1%雙抗(青霉素100 U/ml、鏈霉素0.1 mg/ml)進行常規培養，調整細胞至最佳狀態，計數后調整濃度，細胞密度為1×105/ml；②吸取2.5 μl miR-145-3P mimic/inhibitors[均由廣州閱博生物技術公司負責設計合成，其中miR-145-3P mimic為miR-145-3P的模擬物(mimic組)，miR-145-3P inhibitors為miRNA抑制物(inhibitor組)，均為即用型]，同時設立轉染對照組[siR-RiboTMTransfection Control(Cy3)，Standard，1 nmol]，三組各10株；③取1 μlRNAimax試劑加入Opti-MEM混合液，輕柔混勻，將稀釋好的試劑在室溫下靜置20 min；④在24孔細胞平板中加入500 μl細胞懸液，混勻，miR-145-3P終濃度為150 nM(miR-145-3P inhibitor為250 nM)；⑤收集細胞，以流式細胞儀(FC500MCL，美國貝克曼庫爾特公司)檢測轉染5 d內細胞凋亡情況。

1.2.5miR-145-3p基因作用靶點分析 采用生物信息學軟件及網站miRanda、Targetscan等預測miR-145-3p與凋亡、自噬相關作用的靶點。以westren blot試驗檢測上述轉染細胞中P21、ULK1、LAMP2水平：配制5%濃縮膠(1、2、3、4 ml)、12%分離膠(5、10、15、20 ml)，放置在4 ℃冰箱備用，后取適量蛋白及5×loading buffer按4∶1混合，進行電泳轉膜、封閉與抗體反應、顯影、曝光成像。

1.3統計學方法采用SPSS 19.0軟件處理數據。計量資料以均數±標準差表示，組內比較采用配對樣本t檢驗，組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內不同時點OD值及不同組間P21、ULK1、LAMP2水平比較采用重復測量數據的方差分析。P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1MM組及正常組miR-145-3p表達水平比較

MM組血漿及U266、RPMI-8266、LP-1、H929細胞株中miR-145-3p表達水平均低于正常組(P< 0.05)。見表1。

表1 MM組及正常組miR-145-3p表達水平比較

*與正常組比較，P< 0.05

2.2不同轉染細胞中OD值比較轉染后隨時間延長，三組OD值均增加，且轉染后3 d及5 d OD值大小分別為mimic組<對照組

表2 不同轉染細胞中OD值比較

*與轉染1d比較，P< 0.05；#與對照組比較，P< 0.05；&與inhibitor組比較，P< 0.05

2.3不同轉染細胞中P21、ULK1、LAMP2水平比較轉染5 d后，mimic組P21水平高于inhibitor組、對照組，而ULK1、LAMP2水平低于inhibitor組、對照組(P< 0.05)。見表3、圖1。

表3 不同轉染細胞中P21、ULK1、LAMP2水平比較

*與對照組比較，P< 0.05；#與inhibitor組比較，P< 0.05

3 討論

MM是起源于骨髓漿細胞的血液系統惡性腫瘤，患者骨髓中漿細胞克隆性增殖積聚，分泌單克隆免疫球蛋白或其片段，造血干細胞移植為治療MM最有效方法，但受脊髓來源、配型及高醫療費因素影響，限制了其在臨床的應用，而新型靶向藥物應用為MM提供了新的選擇，明確MM作用機制是研制新型靶向藥物的關鍵[7]。大量研究證實，表觀遺傳學調控方式，包括miRNA、DNA甲基化、組蛋白修飾等調控在MM發生發展中起著重要作用，徐艷妮等[8]的研究發現miRNA家族中miR-29a、miR-155、miR-16值變化可作為MM的分子生物學診斷標志，其中miR-29a/miR-16值對MM診斷價值最高。而iR-145為近年來新發現的參與急性髓系白血病等細胞侵襲、轉移、增殖、分化、凋亡的miRNA分子[9]，有miR-145-5p、miR-145-3p兩種形式，已有研究證實miR-145-5p在肺鱗狀細胞癌、前列腺癌發病中起著重要作用，而關于miR-145-3p在MM中的作用機制尚不明確[10，11]。

圖1 電泳結果(NC-miR為陰性對照)

本次研究結果顯示熒光定量MM組血漿及細胞株(U266、RPMI-8266、LP-1、H929)中miR-145-3p水平均較正常組低，證實miR-145-3p在MM患者的血漿及細胞株中均發生了表達下調，體內體外實驗結果均表明，在U266、RPMI-8266、LP-1、H929細胞株中低表達miR-145-3p可能促進MM發生發展，具有一定的臨床應用潛力。藥物主要通過抑制NF-κB的核轉位，下調caspase蛋白酶家族等途徑而誘導細胞凋亡，在MM藥物治療中，部分患者會出現caspase家族蛋白調控失控，導致凋亡途徑異常，對地塞米松等藥物耐受，因此分析其凋亡機制十分必要[12]。本次研究則發現，在分別轉染miR-145-3p mimic、inhibitor后，隨時間延長，mimic組、inhibitor組、陰性對照組OD值均增加，且轉染后3 d、5 d OD值大小分別為mimic組<對照組

綜上所述，miR-145-3p在MM患者中呈低表達狀態，可能通過激活P21、抑制ULK1/LAMP2信號通路而促進細胞凋亡、自噬作用。