混菌發酵對貴人香低醇甜白葡萄酒的香氣影響

2019-03-08 01:43:32祝霞王媛劉琦趙丹丹韓舜愈楊學山

食品與發酵工業 2019年4期

祝霞，王媛，劉琦，趙丹丹，韓舜愈，楊學山*

1(甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅蘭州，730070) 2(甘肅省葡萄與葡萄酒工程學重點實驗室，甘肅蘭州，730070)

酒精含量低(1%～7%)且香氣濃郁、酸度適中、口味偏甜、色澤清新的甜型白葡萄酒，不但降低了高酒精度對人體的危害，同時富含維生素、黃酮、白藜蘆醇等保健功能成分，深受女性和年輕消費者的青睞[1-3]。目前，國內外主要通過減少可發酵糖分[3]、脫醇[4]以及采用添加SO2終止發酵[5]等特殊的發酵模式生產低醇葡萄酒，在降低酒精度的同時不可避免的造成了香氣成分損失。

香氣是決定葡萄酒，尤其是白葡萄酒品質的關鍵要素，也是體現不同葡萄酒產品風格及特征差異的主要呈現方式[6-7]。在葡萄酒發酵過程中，微生物對發酵香氣化合物的產生具有重要影響[8]。早期普遍認為非釀酒酵母(non-Saccharomycescerevisiae)菌株對酒精、SO2等釀酒因子的耐受性不強，不適合葡萄酒發酵[9]。但近年來許多研究表明，合理的利用非釀酒酵母發酵可有效提高葡萄酒香氣品質。CONTRERAS等[10]、VARELA等[11-12]釀造葡萄酒時均發現，美極梅奇酵母(Metschnikowiapulcherrima)與釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)共同發酵能明顯提高酒樣中花香及果香味；原苗苗等[13]研究發現戴爾有孢圓酵母(Torulasporadelbrueckii)與S.cerevisia混合發酵增加了赤霞珠葡萄酒中香氣化合物種類和含量，尤其是乙基酯類含量，提升了葡萄酒的香氣和復雜性。接種扁平云假絲酵母(Candidahumilis)與S.cerevisiae產生較高含量的酯類化合物，其中丁酸乙酯的含量提高了3.77倍，促進酒樣花果香的形成[14]；申靜云等[15]研究發現混菌發酵的威代爾冰葡萄酒顯示了獨特的風味成分和高濃度的發酵香氣化合物，從而改善了純種釀酒酵母菌株酒精發酵后香氣單一、風味同質化的問題。但利用非釀酒酵母在發酵初期接種增殖時大量消耗糖、產乙醇能力弱、合成香氣化合物豐富的特點，混菌發酵生產低醇葡萄酒的相關研究未見報道。

本實驗以甘肅河西走廊產區貴人香(Italian Riesling)葡萄為原料，分別選用M.apulcherrima、T.delbrueckii與S.cerevisia進行順序接種，篩選產香性能較優的發酵組合，并通過微釀實驗驗證混菌發酵對低醇葡萄酒香氣品質的影響，以期為開發新型高品質、多類型的低醇葡萄酒提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

貴人香葡萄采自甘肅莫高實業發展股份有限公司黃羊鎮葡萄種植基地，含糖量約為21.0 Brix%，可滴定酸(以酒石酸計)5.65 g/L，pH 3.37。

釀酒酵母Aroma White，意大利Enartis公司；Mstschnikowiapulcherrima346，法國Lallemand公司；Torulasporadelbrueckii，丹麥Christian D.A. Hansen公司。

α-萜品醇、β-香茅醇、香葉醇、里那醇、(Z)-橙花叔醇、里那醇、2-辛醇、β-大馬士酮、己酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸乙酯、己酸甲酯、癸酸乙酯、戊醇、己醇、辛酸、橙花醇、苯乙醇、金合歡醇等香氣標準品(色譜純)，美國Sigma公司；果膠酶(EX-V)，法國Lallemand公司；偏重亞硫酸鈉、NaCl等其他常規試劑，天津市光復精細化工研究所；

1.2 儀器與設備

TRACE1310氣相色譜-質譜聯用儀、ISQ型單四級桿質譜儀，美國Thermo Scientific公司；色譜柱DB-WAX(60 m×2.5 mm×0.25 μm)，美國Agilent Technologies公司；固相微萃取(SPME)裝置、50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅萃取頭，美國Surpelco公司；錯流過濾機(中空纖維膜柱，0.2 μm，6-10 L/h)，北京德潤鑫鼎工程技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株活化

非釀酒酵母菌株活化：將M.pulcherrima、T.delbrueckii活性干粉分別溶于10倍體積的ddH2O中，28 ℃ 恒溫水浴活化10 min；再加入等體積貴人香葡萄汁，23 ℃恒溫水浴活化10 min。

釀酒酵母菌株活化：將釀酒酵母菌株干粉溶于10倍體積的ddH2O中，28 ℃恒溫水浴活化10 min；再加入等體積的非釀酒酵母菌株貴人香葡萄發酵液(對照組加貴人香葡萄汁)，23 ℃恒溫水浴活化10 min。

1.3.2 混菌發酵接種方式

依據參考文獻[10-14]和預實驗香氣測定結果，選擇采用先接種非釀酒酵母菌株，后接種釀酒酵母菌株的順序接種方式進行低醇白葡萄酒釀造，具體處理見表1。

表1 接種處理方式單位：mg/LTable 1 Inoculation treatment

注：A組：先接種M.pulcherrima發酵至酒精度為3.5%時再接種S.cerevisia進行混合發酵；B組：先接種T.delbrueckii發酵至酒精度為3.5%時再接種S.cerevisia進行混合發酵；C組：單獨接種S.cerevisia發酵，以該組為對照。

1.3.3 釀造工藝

貴人香葡萄→除梗破碎、過濾澄清(添加40 mg/L SO2、20 mg/L果膠酶)→貴人香葡萄清汁→接種酵母(處理A、B、C)→23 ℃恒溫發酵至酒精度為6.5%→0 ℃恒溫靜置3d→取澄清液進行錯流過濾→灌裝

得到貴人香低醇甜型白葡萄酒分別取10 mL A、B、C處理發酵后的樣品于15 mL離心管中，密封保存于-80 ℃以備測揮發性香氣化合物，每組實驗重復3次。

1.3.4 香氣成分分析

1.3.4.1 香氣成分的提取

參照本實驗室優化的頂空固相微萃取方法。取8 mL待測酒樣于15 mL頂空瓶中，加入2.4 g NaCl和10 μL 4-甲基2-戊醇(2 004 mg/L)，加磁力攪拌轉子，密封并搖勻，置于恒溫磁力攪拌器中，40 ℃下水浴平衡30 min后頂空萃取30 min。

1.3.4.2 GC-MS條件

采用本實驗室建立的方法。毛細管色譜柱為DB-WAX(60 m×2.5 mm×0.25 μm)；升溫程序：50 ℃保持5 min，以3.0 ℃/min升溫至200 ℃，保持15 min，進樣口溫度 240 ℃，高純氦氣(He)流速1 mL/min，不分流進樣。質譜接口溫度280 ℃，電子轟擊離子源(EI)，離子源能量70eV，質譜掃描范圍20～350m/z。

1.3.4.3 定性與定量

參照原苗苗等[13]、申靜云等[15]的方法，在質譜全離子掃描模式下，采用保留指數(RI)和NIST-11、Wiley及香精香料譜庫檢索比對進行定性分析。對萜烯類、高級醇和酯類中已有標準品的化合物，利用標準曲線(R2>0.995)定量，無標準品的化合物采用化學結構、官能團相似、碳原子數相近的標準物質進行半定量。

1.3.5 成品酒樣理化指標測定

總酸、揮發酸、殘糖、酒精度、總酚等基本理化指標參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》進行[1]。

1.3.6 成品酒樣感官分析

感官品評實驗由9名經過葡萄酒品嘗培訓的專業人員進行3輪盲品。參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》及VARELA等[11]的方法，對各酒樣進行隨機編號，分別從外觀、香氣和風味等方面具體評價(表2)。評價結果使用7分結構化數值尺度來量化，0～7分表示強烈程度逐漸增大。

表2 貴人香低醇白葡萄酒感官評價標準Table 2 Criteria for sensory evaluation of Italian Riesling low alcohol sweet white wine

1.4 數據統計分析

利用Microsoft Office Excel 2013對樣本(n=3)所得數據進行基本處理，IBM SPSS Statistics 19.0分析軟件進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 混菌發酵酒樣香氣成分GC-MS分析

不同酵母菌株組合(A、B、C)發酵酒樣中檢測出的揮發性香氣化合物種類及含量見表3。

3組酒樣共檢出105種揮發性香氣化合物，包括44種酯類(約占香氣總量的67.81%～41.05%)、18種醇類(42.03%～17.42%)、14種有機酸類(24.64%～12.85%)、13種萜烯類(1.07%～0.50%)及16種其他物質(2.55%～1.11%)，但各發酵實驗組中檢測到香氣化合物及含量差異較大。

2.1.1 酯類化合物

大多數酯類可以賦予葡萄酒濃郁的花香和果香氣味，增加酒體的香氣復雜性和典型性[16]。

表3 混菌發酵貴人香酒樣中揮發性香氣化合物的GC-MS分析Table 3 GC-MS analysis of volatile compounds in Italian Riesling wine by co-fermentation

續表3

編號中文名保留指數(RI)A組B組C組含量/(μg·L-1)OAV含量/(μg·L-1)OAV含量/(μg·L-1)OAV閾值/(μg·L-1)香氣描述A28肉豆蔻酸乙酯2 055.009.59±0.90nd5.63±0.52nd0.59±0.08nd2 000.00椰子、蜂蠟香A29甲酸-2-苯乙酯 dnd0.28±0.01ndndnd\A30己酸-2-苯乙酯 dndndnd0.45±0.17nd\A31辛酸-2-苯乙酯3.67±0.10nd4.07±0.11ndndnd\A32乙酸苯甲酯4.96±0.10nd4.45±0.94ndndnd\A33乙酸苯乙酯1 840225.24±19.990.90860.35±33.343.4423.09±4.460.09250.00花果香,蜜糖味,含羞草香A34苯乙酸乙酯 dndndnd0.18±0.03nd\A35丁酸苯乙酯6.94±2.00nd2.91±0.01ndndnd\A36棕櫚酸乙酯2 248.0021.71±1.000.0116.53±4.160.010.76±0.05nd1 500.00花香,香蕉,梨香A372-己烯酸乙酯1 245.00ndnd6.46±0.01nd0.39±0.06nd\A383-壬烯酸乙酯 dnd1.70±0.00ndndnd\A398-壬烯酸乙酯1.32±0.01nd1.01±0.00ndndnd\A404-癸烯酸乙酯 dndndnd21.34±6.21nd\A419-癸烯酸乙酯1 697.00392.29±21.003.92465.59±39.094.6621.46±0.010.21100.00溫柏果香A426-壬烯-1-醇乙酸酯2.28±0.34nd2.39±0.01ndndnd\A43十一碳烯酸乙酯5.21±0.39nd3.47±0.04ndndnd\A443,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇甲酸酯3.41±0.17nd1.41±0.45ndndnd\共計3 883.468 155.50297.28B1戊醇1 2561 682.19±30.000.031 270.37±95.290.02123.45±4.53nd64 000.00雜醇味,面包香B2己醇1 358205.62±19.910.03186.86±18.990.024.05±0.08nd8 000.00果香,青香B3辛醇1 40019.33±1.000.4817.34±0.490.432.60±0.180.0640.00茉莉、檸檬味B4癸醇1 7655.79±0.950.013.34±0.010.010.58±0.00nd400.00橙花香B5壬醇1 658.003.60±0.080.728.48±0.201.700.87±0.090.175.00果香、薔薇香B6異丁醇1 100.0024.44±0.460.46nd21.03±0.00nd1.63±0.25nd40 000.00溶劑味,生青味B71-辛烯-3-醇1 447.00ndnd2.74±0.01ndndnd蘑菇香B82-癸烯-1-醇 dnd9.82±1.00ndndnd\B93-壬烯-1-醇 dndndnd0.76±0.16nd\B106-壬烯-1-醇1 715.006.98±0.08nd3.64±0.01nd0.77±0.12nd\B119-癸烯-1-醇 dnd3.97±0.03nd0.42±0.01nd\B12十一烯醇 dnd3.53±0.00ndndnd\B13月桂醇 dndndnd0.39±0.00nd\B14肉豆蔻醇