QuEChERS/超高效液相色譜-串聯質譜法快速測定土壤中19種氟喹諾酮類抗生素殘留

陳 磊,吳赟琦,趙志勇,趙曉燕,周昌艷*

( 1.上海市農業科學院 農產品質量標準與檢測技術研究所，上海 201403；2.農業農村部農產品質量安全風險評估實驗室(上海)，上海 201403；3.河南農業大學 食品科學技術學院，河南 鄭州 450002)

氟喹諾酮類抗生素(FQs)被廣泛應用于動物和人類感染性疾病的治療，具有生物活性和累積性，可通過多種途徑進入環境[1]，沉積物/土壤的吸附作用是其遷移的主要途徑之一[2]。FQs對植物和水生生物有毒，由于其在全球范圍內的大量使用以及對土壤的高親和力，很可能通過植物進入人類食物鏈，對生態系統和人類健康構成威脅[3]。

QuEChERS是相對較新的樣品前處理方法，通常包括乙腈提取、鹽析分層和基質分散萃取凈化等步驟，已被廣泛應用于食品和環境樣品的預處理[10]。QuEChERS方法用于測定土壤中有機化合物殘留時，一般需加水重構基質條件，采用超聲等輔助提取，改進凈化材料消除復雜基質干擾，以提高檢測方法的回收率[11]。Guo 等[12]開發了QuEChERS-液相色譜-串聯質譜測定豬糞中抗生素的方法，其中喹諾酮類抗生素的回收率低，其采用內標法消除基質效應[13]。Zhao 等[14]采用離子交換固相萃取-液相色譜-串聯質譜法測定有機肥料中的抗生素，通過內標法校正環丙沙星和諾氟沙星的定量結果。汪建妹等[15]采用QuEChERS結合柱凈化的超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)法測定有機肥中的46種抗生素，通過提高緩沖溶液pH值的方法來提升喹諾酮類抗生素的回收率。研究顯示，提高緩沖液pH值并不能保證FQs的回收率均較理想[9]。本文建立了QuEChERS前處理結合UPLC-MS/MS快速檢測土壤中19種FQs的方法，該方法添加內標物校正，采用超聲輔助提取，改進了快速基質分散固相萃取(d-SPE)凈化柱，具有較好的實用價值。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

Na2HPO4·2H2O、C6H8O7·H2O(分析純，上海Macklin公司)，Na2EDTA·2H2O(分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司)，甲醇、乙腈、乙酸(色譜純，德國Merck公司)，甲酸(分析純，美國Sigma-Aldrich公司)，Nylon66濾頭(0.22 μm，美國Pall公司)，鹽包(上海CNW公司，每袋含4 g硫酸鎂、1 g 氯化鈉、0.5 g檸檬酸氫二鈉、1 g檸檬酸鈉)，基質分散固相萃取凈化柱(d-SPE，北京廣普達公司)，進樣瓶(美國Agilent公司)。實驗用水由Milli-Q超純水儀制備。0.1 mol/L EDTA-McIlvaine緩沖液：將15 g Na2HPO4·2H2O、13 g C6H8O7·H2O和36.6 g Na2EDTA·2H2O溶于1 L水中制得[12]。

1.2 儀器與設備

ST-16R高速冷凍離心機(美國Thermo公司)，多管式旋渦混合器(美國Talboys公司)，2500 TH超聲波清洗器(上海安譜公司)，移液槍(日本島津公司)，N-EVAP112氮吹儀(上海曲晨機電技術公司)，Waters Acquity高效液相色譜儀，C18色譜柱(1.7 μm×2.1 mm×100 mm，美國Waters公司)，Qtrap-5500三重四極桿串聯質譜儀(美國SCIEX公司)。

1.3 標準溶液的配制

標準品：氧氟沙星、諾氟沙星、鹽酸環丙沙星、恩諾沙星、甲磺酸達氟沙星、氟甲喹、鹽酸二氟沙星、依諾沙星、司帕沙星、奧比沙星、左氧氟沙星水合物、帕珠沙星、安妥沙星、那氟沙星、培氟沙星、氟羅沙星、鹽酸洛美沙星、鹽酸沙拉沙星、麻保沙星，以及氘代恩諾沙星(ENR-D5)、氘代諾氟沙星(NOR-D5)、氘代環丙沙星(CIP-D8)，純度均大于98%，購自德國Dr.Ehrenstorfer 公司。標準品均以甲醇配制成200～1 000 mg/L的單標儲備液，-20 ℃儲存，再用甲醇分別配制上述19種抗生素(10 mg/L)和3種內標物(10 mg/L)的混合標準溶液，-20 ℃儲存。

定量分析時，除氟甲喹、奧比沙星與那氟沙星不用內標法校正外，其它16種FQs均采用內標法進行校正。其中，氧氟沙星、恩諾沙星、達氟沙星、二氟沙星、司帕沙星、左氧氟沙星、培氟沙星、氟羅沙星、洛美沙星、沙拉沙星和麻保沙星以ENR-D5為內標；諾氟沙星、依諾沙星、帕珠沙星與安妥沙星以NOR-D5為內標；環丙沙星以CIP-D8為內標。

1.4 分析條件

液相色譜條件：柱溫為40 ℃，流動相為甲醇(A)、0.1%甲酸水(B)，進樣體積為3 μL，流速為0.3 mL/min。流動相洗脫梯度：0～2.0 min，20%A；2.0～5.0 min，20%～30%A；5.0～5.5 min，30%～90%A；5.5～7.0 min，90%～95%A；7.0～7.1 min,95%～20%A；7.1～8.0 min，20%A。

質譜條件：電噴霧電壓5.5 kV，離子源溫度500 ℃，采用正離子多反應監測模式，氣簾氣壓力：275.6 kPa，碰撞氣壓力：55.12 kPa，霧化氣壓力：344.5 kPa。目標抗生素的母離子(Q1)、定性/定量離子(Q3)、去簇電壓(DP)、碰撞能量(CE)等質譜條件見表1。

表1 19種FQs的質譜參數Table 1 Mass spectrometric parameters of 19 FQs

*quantitative ion

1.5 土壤樣品的制備

空白土壤樣品采自上海市奉賢區農田0～20 cm的表層土壤，其pH值為7.5，有機質含量為1.6%，經檢測未含有目標抗生素。樣品經剔除雜物，自然風干后過20目土壤篩(孔徑0.83 mm)。

1.6 提取與凈化步驟

稱取5.0 g樣品置于50 mL離心管中，加入200 μg/kg的內標物質，靜置1 h，加入10 mL 0.1 mol/L EDTA-McIlvaine緩沖液，渦旋1 min，再加入10 mL乙腈，渦旋1 min后，25 ℃下超聲提取15 min，以4 000 r/min離心5 min，將上清液轉入50 mL離心管中，并將沉降的土樣再次超聲提取，收集2次提取后上清液，用0.1 mol/L EDTA-McIlvaine緩沖液與乙腈混合溶劑(體積比1∶1，現配現用)將2次提取液補足至40 mL。加入2袋鹽包后，立即密封離心管，劇烈搖動1 min，使上述40 mL提取液分層，以4 000 r/min離心5 min后，吸取2 mL上層清液過d-SPE柱(在5 mL PVC針筒頂端裝有150 mg無水MgSO4、15 mg PSA、15 mg C18，填料兩端放有隔墊)快速凈化。為減少儀器進樣的溶劑效應，取過柱后的溶液1 mL置于玻璃試管中，在45 ℃水浴條件下氮吹至近干，用1 mL乙腈-0.1%甲酸水溶液(體積比20∶80)復溶，過0.22 μm有機相濾頭，上機測定。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

研究表明[13,15]，C18柱適于氟喹諾酮類抗生素殘留的分析，因此本實驗對比了T3(1.6 μm,2.1 mm×100 mm)、BEH C18(1.7 μm,2.1 mm×100 mm)和HSS T3(1.8 μm,2.1 mm×100 mm)3種不同粒徑ACQUITY UPLC C18柱的分離效果。結果表明：此3種色譜柱對19種目標物的分離度均較好，其中經BEH C18色譜柱分離后的目標物峰形更好，所以選其作為分離色譜柱。實驗還對比了甲醇-0.1%甲酸水和乙腈-0.1%甲酸水作為流動相時的分離效果，結果顯示甲醇-0.1%甲酸水的分離效果和峰形較好，因此選擇流動相為甲醇-0.1%甲酸水。

2.2 提取條件的優化

2.2.1提取劑的優化氟喹諾酮類抗生素易與土壤中的金屬離子結合，文獻[14]通過添加EDTA-McIlvaine緩沖液，使EDTA與金屬離子形成絡合物，將土壤中的目標化合物游離出來，再添加有機溶劑進行提取。本實驗加入10 mL 0.1 mol/L EDTA-McIlvaine緩沖液后，考察了分別加入10 mL的乙腈、甲醇-乙腈(體積比1∶3)、乙腈-乙酸(體積比9∶1)提取劑在25 ℃超聲水浴中提取15 min，重復提取2次的回收率。結果表明：乙腈作為提取劑時，19種目標物的回收率均大于66.8%，而經其它2種溶劑提取的部分目標物回收率低于50.0%，因此選擇0.1 mol/L EDTA-McIlvaine緩沖液-乙腈(1∶1)作為混合提取劑，提取時先加緩沖液，再加乙腈。

2.2.2提取方式的優化以EDTA-McIlvaine緩沖液和乙腈(1∶1)為提取劑，提取15 min，重復提取2次條件下，對渦旋振蕩和25 ℃超聲提取2種提取方式進行了比較。結果發現：25 ℃超聲提取對各目標物的回收率均大于渦旋振蕩提取。因此選擇25 ℃超聲水浴作為提取方式。

2.2.3提取時間的優化以EDTA-McIlvaine緩沖液和乙腈(1∶1)為提取劑，25 ℃超聲提取2次條件下，考察了提取時間(10、15、20 min)的影響。由圖1可知，提取時間為10 min時，DIF和ORB的回收率僅為64.4%和53.3%；提取時間為15 min時，目標物的回收率均在70.2%以上，平均回收率為85.1%；提取時間為20 min時，目標物的平均回收率可達88.5%。為節省操作時間，最終選擇提取時間為15 min。

2.2.4提取次數的優化以EDTA-McIlvaine緩沖液和乙腈(1∶1)為提取劑、25 ℃超聲提取15 min條件下，考察了提取次數(1次、2次、3次)的影響。結果表明：19種目標物的回收率隨提取次數的增加而增大，提取1次時目標物的平均回收率為59.3%,提取2次和3次時的平均回收率分別為84.5%和85.4%，為節省實驗時間，最終選擇提取2次。

2.3 凈化條件的優化

土壤經提取后含有雜質，為減少基質效應，提高檢測靈敏度，本實驗采用d-SPE凈化柱進行快速凈化。對d-SPE凈化柱中裝填3種凈化材料(無水MgSO4+PSA+C18)的用量組合進行了優化，6種組合分別為[16]：A(100 mg+10 mg+25 mg)、B(100 mg+15 mg+15 mg)、C(100 mg+25 mg+25 mg)、D(100 mg+25 mg+10 mg)、E(150 mg+15 mg +15 mg)、F(150 mg+25 mg+25 mg)。土壤樣品加標200 μg/kg后，采用“1.6”方法超聲提取2次，加鹽分層后，分別移取2 mL上清液，用以上6種組合材料凈化。結果表明：當PSA或C18的用量為25 mg時有2～3個抗生素的回收率低于60%；組合E的回收率最高，回收率為73.8%～96.3%，最終選取組合E(150 mg無水MgSO4+15 mg PSA+15 mg C18)作為d-SPE凈化劑。

圖1 不同提取時間下19種FQs的回收率

2.4 方法驗證

2.4.1線性范圍為消除基質效應對目標物檢測的影響，用樣品空白基質配制標準溶液，以目標物的質量濃度(X，μg/L)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標繪制標準曲線。由表2可知，除了ENO、ANT的線性范圍為5.0～200 μg/L，NOR、PEF的線性范圍為2.0～100 μg/L外，其余目標物的線性范圍均為1.0～100 μg/L；相關系數(r2)為0.992～0.998。

表2 19種FQs的相關系數(r2)、線性范圍、檢出限、定量下限、回收率與相對標準偏差(n=5)Table 2 Correlation coefficients(r2),linear ranges,LODs,LOQs,recoveries and RSDs(n=5) for 19 FQs

2.4.2方法檢出限與定量下限在空白土壤樣品中分別添加0.1、0.2、0.5、1.0、5.0 μg/kg的19種FQs混合標準溶液(n=5)，經前處理后上機檢測，以各目標物的定性、定量離子質譜圖響應值大于3倍信噪比(S/N)時對應的加標水平為方法檢出限(LOD)，大于10倍信噪比時對應的加標水平為定量下限(LOQ)，得到土壤中19種FQs的LOD為0.2～1.0 μg/kg，LOQ為1.0～5.0 μg/kg。19種FQs在空白土壤基質標準溶液(5.0 μg/L)中的定量離子提取色譜圖見圖2，各目標化合物在2.5～7.0 min內出峰，色譜峰形較好。

2.4.3回收率與相對標準偏差在空白土壤樣品中添加10、50、200 μg/kg的19種FQs混合標準溶液，每個加標水平設5個重復，回收率和相對標準偏差(RSD)見表2。結果表明：19種FQs在3種加標水平下的回收率為65.2%～104%，平均回收率分別為79.8%、82.6%和85.8%，RSD為1.8%～14%，基本滿足GB/T 27404-2008 《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》標準對回收率和RSD的要求[17]，方法適用于實際土壤樣品的檢測。

2.5 實際樣品檢測

采用本方法對采自上海市郊區35個不同類型農田的土壤樣品中FQs殘留進行分析，測得土壤中19種FQs的總含量為9.4～124.9 μg/kg。其中主要是CIP殘留，其檢出率為100%，檢出量為9.4～79.9 μg/kg，平均含量為33.1 μg/kg；其次是NOR、ENR、OFX，檢出率分別為71%、57%、31%，平均檢出量分別為7.3、7.8、5.0 μg/kg；其它抗生素的檢出率均在10%以下，平均檢出量均在10 μg/kg以下。Sun 等[18]對長江三角洲地區241個土壤樣品檢測發現，OFX、ENR、CIP和NOR的總含量平均值為48.8 μg/kg，檢出率分別為72%、75%、83%和73%，平均檢出量分別為5.86、9.98、27.7、11.2 μg/kg。趙晶等[19]檢測發現，上海市崇明島禽畜養殖場周圍土壤中OFX、ENR、CIP和NOR的總含量平均值為 144 μg/kg，OFX、ENR和 CIP 的檢出率均為100%，NOR的檢出率為 91%，平均檢出量分別為8.1、86.8、32.0、17.4 μg/kg。本實驗對土壤樣品中FQs殘留的檢測結果與文獻一致。雖然本實驗中CIP、NOR、ENR和OFX的檢出值不高，但檢出率較高，為了保障禽畜糞污資源化利用以及農產品質量安全，應對長期或大量施用糞肥和有機肥的農田土壤中上述4種抗生素進行風險評估。

3 結 論

本文建立了QuEChERS/UPLC-MS/MS結合同位素內標法同時測定土壤中19種FQs殘留的分析方法，各抗生素的定量下限為1.0～5.0 μg/kg，在10、50、200 μg/kg 3個加標水平下的平均回收率分別為79.8%、82.6%和85.8%，RSD不大于14%。該方法操作簡單、快速，準確度較高，能夠滿足目前土壤中氟喹諾酮類抗生素檢測和風險評估的需求。