膠體金修飾電極測定魚樣中組胺的方法研究

周嬋媛，趙曉娟*，王春利，曾曉房，白衛東

(1.仲愷農業工程學院 輕工食品學院，廣東 廣州 510225；2.中華人民共和國江門海關，廣東 江門 529000)

生物胺(Biogenic amines，BAs)是一種相對分子量較低的有機化合物，其化學結構中至少含有一個氮原子，主要由其前體氨基酸通過相應的氨基酸脫羧酶代謝[1]生成，廣泛存在于食物[2-3]和飲料中[4-5]。生物胺通常被認為是魚類及其產品或貝類中微生物衰變程度的關鍵性化合物[6-7]，而組胺(Histamine)是這類化合物中生物化學活性最強的化合物之一[8]，也是人體體液中重要的生物標志物[9-10]。通常人們無法從魚的顏色和氣味觀察到組胺的存在，但是組胺會引起鯖魚綜合征：人體攝入過量的組胺可引起特定的不良生理和毒性作用，如對心臟、運動神經元、平滑肌和胃產生負面影響[11]，組胺通常被認為是食品生產、儲存和運輸過程中用于質量控制監測的生物標志物之一[12]。因此，有必要建立一種快速、靈敏地測定組胺的分析方法。

膠體金(AuCS)又稱納米金溶膠，是由氯金酸被還原成金后形成的顆粒懸浮液，其分散相粒子直徑多在1～100 nm，且均勻、穩定、呈單一分散狀懸浮在溶液中，形成一種納米金膠體溶液，其顏色呈桔紅色到紫紅色[13]。納米金具有大的比表面積、表面等離子體共振特性、小尺寸效應、催化特性、光學特性以及獨特的生物親和性等性能，在工業催化、生物醫藥、生物分析化學、食品安全快速檢測等多個領域有著廣泛的應用[14-16]。

本文采用膠體金修飾的玻碳電極(AuCS/GCE)，利用電流～時間曲線法(I～t法)建立了一種簡便、靈敏地檢測組胺的分析方法，優化了底液的pH值和組胺的電化學測試方法及條件，考察了修飾電極的電化學性能，并對帶魚和黃花魚樣品中的組胺含量進行測定，以評價該法在實際應用中的適用性。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

KQ118超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Vortex Mixer V6漩渦混勻器(美國安勝科技有限公司)；HR/T20M臺式高速冷凍離心機(湖南赫西儀器裝備有限公司)；BSA124S分析天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)；QSJ-A01F2切碎機(小熊電器股份有限公司)。采用玻碳電極測試組胺的實驗均在CHI660E電化學工作站(上海辰華儀器有限公司)上連接三電極系統模式下進行：玻碳電極為工作電極，Ag/AgCl(飽和KCl溶液)電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，文中所有電勢均以飽和Ag/AgCl電極為參比。

組胺二磷酸鹽、苯乙胺、精胺、腐胺二鹽酸鹽、酪胺鹽酸鹽、亞精胺磷酸鹽六水合物、尸胺二鹽酸鹽、色胺和氯金酸(HAuCl4·3H2O)純度均大約99.8%，購于Sigma-Aldrich公司；硼氫化鈉(NaBH4)、乙酸(CH3COOH)購于天津市福晨化學試劑廠；殼聚糖(CS)購于國藥集團化學試劑有限公司；高氯酸(HClO4)購于上海麥克林生化科技有限公司；正己烷(C6H14)購于天津市永大化學試劑有限公司。0.1 mol/L磷酸緩沖溶液(PBS，pH 7.0)由NaH2PO4·2H2O和Na2HPO4·12H2O儲備液混合配制；帶魚和黃花魚購于超市。所用試劑均為分析純，實驗用水為超純水(18.2 MΩ·cm)，實驗均在室溫下進行。

1.2 玻碳電極的預處理

玻碳電極(GCE)依次在專用絨毛拋光墊上用1.0、0.3、0.05 μm的α-Al2O3粉拋光成鏡面，用水洗凈后，分別于50%硝酸溶液、無水乙醇和水中各超聲1 min，再將電極置于0.5 mol/L硫酸溶液中，于-1.0～1.0 V電位范圍內以50 mV/s的掃描速率進行循環伏安掃描直至得到穩定的響應曲線。最后將處理好的電極放置于室溫下晾干備用。

1.3 膠體金修飾電極(AuCS/GCE)的制備

1.3.1AuCS的制備使用硼氫化鈉為還原劑,CS為保護劑，參考文獻[17]制備AuCS：首先稱取一定量CS充分溶解于30 mL 1.0%乙酸溶液中配成2 mg/mL溶液；在磁力攪拌下加入15 mL 0.01 mol/L的氯金酸溶液，繼續攪拌30 min后，再逐滴加入6 mL 0.1 mol/L的硼氫化鈉溶液，繼續攪拌至溶液呈透明的酒紅色。制備過程中所用玻璃儀器均需在王水(HNO3-HCl，體積比1∶3)中洗凈。

1.3.2AuCS/GCE的制備在預處理好的GCE表面滴加3 μL AuCS，確保AuCS完全覆蓋電極表面，室溫晾干后制得AuCS/GCE。

1.4 樣品前處理

本實驗參考文獻[18]處理樣品：精密稱取2.0 g已粉碎帶魚或黃花魚樣品于50 mL離心管中，加入8 mL 0.4 mol/L高氯酸溶液，渦旋振蕩混勻1 min，以10 000 r/min離心10 min，重復提取一次，合并2次上清液于25 mL容量瓶中，用0.4 mol/L高氯酸溶液定容至刻度。準確移取10.00 mL樣品提取液置于離心管中并加入10 mL正己烷，漩渦振蕩5 min，棄去上層有機相，重復提取2次，合并提取液，待測。

加標回收樣品的前處理：精確稱量2.0 g已粉碎樣品于50 mL離心管中，加入組胺配成不同濃度(0.1、0.26、0.5 mmol/L)的加標溶液，在優化條件下測定，平行實驗3次。

1.5 檢測方法

采用三電極電化學測試系統，以pH 12.0 PBS為支持電解質。在初始電位1.0 V條件下，于勻速攪拌的PBS中，利用I～t法掃描約300 s直至基線穩定，然后每隔50 s加入定量的組胺標準溶液或樣品溶液。

2 結果與討論

2.1 工作電極的選擇

分別將金電極(GE)、鉑電極(PE)和GCE置于1.0 mmol/L組胺的PBS溶液(pH 12.0)中，利用方波伏安法(SWV)在0.2～1.2 V電位范圍內進行掃描。結果發現，與GE和PE相比，組胺在GCE上的氧化峰電流明顯(圖1)，說明組胺在GCE表面發生氧化反應時具有較高的響應靈敏度，所以選用GCE為測定組胺的工作電極。

2.2 底液pH值的選擇

采用Tris-HCl(pH 6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)和PBS(pH 4.0、7.0、10.0、12.0)分別配制1.0 mmol/L組胺溶液，考察各濃度組胺溶液在GCE上的響應電流值。發現在不同pH值的Tris-HCl底液中組胺均未產生氧化峰。在pH值為4.0、7.0、10.0的PBS底液中(圖2A)，1.0 mmol/L組胺未見明顯的響應電流；而當PBS底液的pH值達12.0時，組胺出現明顯的氧化峰，且峰形良好，這可能是由于組胺發生電子轉移時伴隨著質子的轉移，從而使其電化學響應與底液的pH值具有依賴關系，隨著底液pH值的升高，組胺的氧化峰電位負移至測試的電位范圍內。進一步考察了不同濃度的組胺溶液(以pH 12.0 PBS為底液)在GCE上的電化學響應(圖2B)，發現響應峰電流隨組胺濃度的增加而增大。因此，實驗選擇pH 12.0的PBS作為測試底液。

2.3 電化學測試技術的選擇

將GCE置于0、10.0、100、1 000 μmol/L組胺溶液(用pH 12.0 PBS溶液配制)中進行循環伏安法(CV)、SWV、差分脈沖伏安法(DPV)和I～t法掃描，結果見圖3。由圖3A、B和C可見，采用CV、SWV、DPV法測試10.0 μmol/L組胺時，其電流值響應小，靈敏度低，無法在實際中應用。而采用I～t法測試1.0 μmol/L組胺(圖3D中出現第1個階梯時的組胺濃度)時具有明顯的響應，表明在測定組胺時，I～t法比其他3種測試方法具有更高的測試靈敏度，故選擇I～t法對組胺進行后續測試。

2.4 電極修飾材料的選擇

分別采用膠體金(AuCS)、粘土(Clay)和膠體金/粘土(AuCS/Clay)對GCE進行修飾，比較組胺在修飾電極上的響應電流值。結果發現，與GCE相比，在電極表面修飾粘土后，響應基線更加穩定平滑，但組胺的響應電流值未發生明顯變化，且粘土修飾膜的穩定性較差，在淋洗和測定過程中易脫落。而AuCS中的殼聚糖具有良好的黏附性，可改善修飾電極的穩定性，使用AuCS和AuCS/Clay修飾電極時均能增加組胺的響應電流，且僅修飾AuCS的電極響應靈敏度增加更顯著，因此，選用AuCS為GCE的修飾材料。實驗進一步考察了AuCS/GE、AuCS/PE和AuCS/GCE 3種修飾電極在1.0 mmol/L組胺的PBS溶液(pH 12.0)中的氧化峰電流，利用SWV在0.2～1.2 V電壓范圍內進行掃描。結果發現，與AuCS/GE和AuCS/PE相比，組胺在AuCS/GCE上的氧化峰電流明顯，且峰形較好，因此選用AuCS/GCE作為測定組胺的工作電極。

2.5 初始電位的選擇

將AuCS/GCE放入1.0 mmol/L組胺溶液中，連接三電極系統，測得開路電位為0.55 V。采用SWV法測定，發現組胺在0.75 V附近有一個明顯的氧化峰。根據開路電位和氧化峰電位，設置I～t法的初始電位分別為0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 V，考察初始電位對不同濃度組胺在AuCS/GCE上電化學響應的影響。結果顯示，初始電位為0.5、0.6、0.7、0.8、1.2 V時，組胺在AuCS/GCE表面均無明顯的響應。當初始電位為0.9、1.0、1.1 V時，組胺在AuCS/GCE上產生了明顯響應，且1.0 V時組胺的響應電流值最大，因此，實驗選擇I～t法測試組胺的初始電位為1.0 V。

2.6 性能測試

2.6.1重現性在相同條件下制備5支AuCS/GCE，分別測試濃度為4.0、7.9 μmol/L的組胺溶液，得其響應電流的相對標準偏差(RSD)分別為3.6%和4.8%，表明AuCS/GCE具有良好的重現性。

2.6.2干擾實驗考察10倍于組胺濃度的腐胺、尸胺、精胺、亞精胺、苯乙胺、色胺和酪胺對測定結果的影響，結果顯示，腐胺、尸胺、苯乙胺、精胺、亞精胺不干擾組胺的測定，而色胺和酪胺產生了明顯的電流響應。由于魚樣中色胺的含量極低[19-21]，在實際應用中基本不干擾測定。而酪胺雖干擾測定，但其在SWV上的氧化峰位于0.45 V左右，與組胺(0.75 V)的氧化峰間隔較遠，采用本方法測定為陽性樣品時可補充SWV實驗進行區分。

圖4 組胺的電流響應值與其濃度的關系曲線

2.7 組胺標準曲線的建立

在優化實驗條件下，使用I～t法考察了不同濃度(0.1、0.35、0.59、0.98、5.8、9.7、14、28、64 μmol/L)組胺在AuCS/GCE上響應電流的變化(圖4)，結果顯示，隨著組胺濃度的增加，I～t曲線呈階梯式下降，其響應電流(-I,μA)與其濃度(c,μmol/L)在0.1～64 μmol/L范圍內呈良好的線性關系，線性方程為：-I=0.053 12c-0.007 17(r=0.997，n=9)，以3倍信噪比(S/N=3)計算得到AuCS/GCE對組胺的檢出限為0.033 μmol/L。

2.8 樣品分析與回收率的測定

取帶魚和黃花魚在優化條件下采用本方法檢測，結果顯示，帶魚中組胺的含量為86.2 mg/kg，在黃花魚中的含量為49.2 mg/kg。對帶魚和黃花魚樣品分別進行0.1、0.26、0.5 mmol/L 3個濃度水平的加標回收實驗，平行測定3次。結果顯示，組胺在帶魚和黃花魚樣品中的回收率分別為94.4%～106%、91.8%～106%，相對標準偏差(RSD)分別為3.2%、2.5%，表明方法具有良好的可靠性和準確度，且實際樣品測試時間小于6 min。

3 結 論

本文建立了一種快速檢測食品中組胺的電化學分析方法，采用AuCS修飾GCE電極，制作簡單、穩定性良好，與未修飾的GCE相比，組胺的電化學響應明顯增強，可用于市售帶魚和黃花魚中組胺含量的測定。