煙草硝酸還原酶基因NIA1啟動子互作蛋白的篩選

周炎，楊惠娟，史宏志，王景，張玉寧

河南農業大學煙草學院，國家煙草栽培生理生化基地，河南鄭州 450002

氮素對煙草的生長發育及其產量品質有著重要影響。硝酸還原酶（NR）是植物氮代謝中硝酸鹽還原的限速酶和調節酶，與 NO3- 的積累關系密切，直接影響到植物氮肥的利用率，在植物氮代謝過程中具有重要作用[1-4]。煙草硝酸還原酶基因NIA（nitrate reductase [NADH]）分為NIA1和NIA2，分別來自普通煙草的父本和母本。研究發現，NR 積累量和活性會影響植株生長情況和硝酸鹽含量，NIA基因的高表達也可增加種子蛋白質的積累量[5-7]，從而直接或間接地影響煙草的品質和安全性。

轉錄因子（Transcriptional Factors）是一類可與啟動子結合并相互作用的蛋白，在基因的轉錄調控過程中起到了重要作用[8-9]，功能上可大體分為激活型和抑制型，可調控特定基因的表達。酵母單雜交系統是一種篩選DNA互作蛋白的有效方法，其突出特點是可在酵母細胞內研究真核細胞的DNA與蛋白質間相互作用，并通過篩選cDNA文庫直接得到與靶序列相互作用的蛋白質基因序列[10-12]。酵母單雜交系統在轉錄因子的篩選上得到了較為廣泛的應用[13]，在煙草中的應用多集中在抗逆性方面，有研究利用酵母單雜交技術在煙草中篩選出了與DRE順式元件結合的抑制型DREBP類轉錄因子[14-15]。而針對NIA基因的互作蛋白研究尚不多見。篩選NIA啟動子序列的互作蛋白可為其轉錄因子的研究奠定基礎，從而更好地調控NIA的表達。

本實驗重點在于NIA1啟動子互作蛋白的篩選。通過克隆煙草硝酸還原酶基因NIA1的啟動子，構建煙草cDNA基因表達文庫，并進行酵母單雜交實驗，旨在篩選NIA1啟動子的互作蛋白，為硝酸還原酶基因的表達調控提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗體系采用 Clontech 公司的Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System。所用菌株為 Y1HGold，pAbAi 質粒用于構建誘餌載體，pGADT7-Rec AD 質粒用于 cDNA 文庫篩選，均購自 Clontech 公司。所用試劑盒：Yeastmaker Yeast Transformation System 2、 Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System、 Easy Yeast Plasmid Isolation Kit；所用試劑：Matchmaker Insert Check PCR Mix 1 / Mix 2、金擔子素 A（aureo-basidin A，AbA）均購自 Clontech 公司；大腸桿菌質粒提取試劑盒購自 OMEGA 公司；DNA marker 購自 Biomed 公司；限制性內切酶購自 TaKaRa 公司；所用到的抗生素為氨芐西林（Ampicillin，Amp）、卡那霉素（Kanamycin，Kan）和金擔子素 A（aureo-basidin A，AbA）。

實驗用K326煙株為河南農業大學煙草栽培生理實驗室培育，用于構建煙草cDNA文庫。PCR產物測序在北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

1.2 NIA1上游啟動子區域的克隆與誘餌序列的獲得

在NCBI數據庫中找到煙草氮代謝關鍵酶NIA1基因（Nicotiana tabacum nia-1 gene for nitrate reductase （EC 1.6.6.1），X14058.1），經過生物信息學分析，截取ATG上游938bp的堿基序列，設計引物，以煙草基因組為模板，通過PCR擴增技術獲得片段，上游引物為NIA1-F：TATATATATGACCCTGCAATGAAAG；下游引物為NIA1-R：AGATTATTCTAAAAAAGAAAGAGAGAT。獲得片段后進行測序，鑒定序列是否與目的片段一致，利用啟動子在線分析網站plantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析獲得片段。

1.3 運用SMARTTM技術構建煙草K326品種cDNA文庫

選取不同發育時期的K326植株，將根、莖、葉、花各組織以液氮速凍，提取各組織RNA進行混合，純化總RNA后富集poly A+ mRNA，利用SMART技術和DSN酶，參照說明書構建煙草歸一化cDNA表達文庫。

1.4 誘餌載體的構建與誘餌報告菌株的獲得

采用 Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System 提供的表達載體pAbAi，以XhoⅠ和HindⅢ分別雙酶切NIA1啟動子序列與表達載體pAbAi，酶切產物經純化后，用T4連接酶連接并轉化大腸桿菌，用含氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）的LB固體培養基篩選陽性克隆，提取質粒，經XhoⅠ和HindⅢ雙酶切后進行電泳鑒定。取酶切片段長度正確的重組質粒進行測序鑒定。

參照 Yeastmaker Yeast Transformation System2 說明書將誘餌載體轉入Y1HGold菌株，轉化液涂布于 SD/-Ura 固體培養基上，3d后挑取單克隆用 Matchmaker Insert Check PCR Mix 1 進行菌落PCR鑒定。

1.5 報告基因本底表達水平的測定

金擔子素A（AbA）能高效抑制酵母細胞的生長，而 pAbAi 載體上含有 AbA 的抗性基因 AUR1-C。一旦有蛋白與 pBait-AbAi 上的誘餌序列結合便可使酵母產生 AbA 抗性，從而篩選出陽性菌落，確定目標文庫質粒。進行文庫篩選前必須先確定 AbA 最低抑制濃度即報告基因的本底表達水平，以排除酵母內源誘餌結合蛋白的干擾。

挑取 SD/-Ura培養皿上正常生長的誘餌菌株，將其懸浮于 0.9%的 NaCl 中，將 OD600值調至約0.002 后涂布在分別含 0、200、400至 1000 ng/mL AbA 的 SD/-Ura 固體培養基上，將完全抑制菌落生長的最低 AbA 濃度確定為文庫篩選時使用的 AbA濃度。

1.6 酵母單雜交文庫的構建和初步篩選

將純化的雙鏈 cDNA 和線性化的 pGADT7-Rec表達載體混合，按照Yeastmaker Yeast Transformation System 2 的使用說明共轉化誘餌酵母。將酵母細胞懸液分別稀釋至1/10、1/100、1/1000 和 1/10000，各取100 μL 稀釋液分別涂布在 SD/-leu 平板上，用于計算篩選的總克隆數。將剩余的約 15 mL 酵母細胞懸液按200 μL/皿涂布在對應濃度的 SD/-leu/AbA 平板上，進行陽性克隆的初步篩選。3～5 d 后統計 SD/-leu 平板上的克隆數，用于計算總克隆數，總克隆數須大于1.0×106。

總克隆數=cfu/涂板體積×稀釋率×細胞懸液總體積。

1.7 陽性互作的鑒定

挑取 SD/-leu/AbA 平板上健康的單克隆，重新點在含AbA的SD/-leu培養基上，3～5天后挑取健康菌落重復這一驟。挑取最終在SD/-leu/AbA平板上生長的菌落，采用 Matchmaker Insert Check PCR Mix 2 進行酵母菌落PCR，取少量產物進行電泳鑒定，將條帶明亮的PCR產物送至公司測序，以T7為引物。數據返回后對序列進行生物信息學分析。選取有生物學意義的序列，采用Easy Yeast Plasmid Isolation Kit提取與其編號對應菌落的質粒并保存。

2 結果與分析

2.1 NIA1基因啟動子的克隆

根據選取的煙草NIA1基因上游序列設計引物 ,通過 PCR 進行擴增。將PCR產物進行電泳鑒定，其長度與目標長度相符（圖1），測得結果表明目標序列已成功克隆（圖2）。將序列在plantCARE網站上進行分析，結果表明，目標序列中含有多個典型的真核生物啟動子順式元件如CAAT-box、TATA-box 等，還存在多種響應元件如GA-motif、GARE-motif，符合啟動子基本特征。

圖1 NIA1基因啟動子片段PCR克隆電泳圖Fig.1 Electrophoretic diagram of cloned NIA1-promoter region

圖2 NIA1基因啟動子片段克隆測定序列Fig.2 Sequencing results of cloned NIA1-promoter fragment

2.2 誘餌報告菌株的轉染與鑒定

將誘餌載體pAbAi-P:NIA1各自轉入Y1HGold菌株，菌落PCR鑒定結果顯示片段長度與理論值（1.35 kb+插入片段長度）相符，說明誘餌載體已成功轉入酵母細胞（圖3）。

2.3 誘餌報告菌株的AbA背景抑制濃度測定

實驗結果表明（圖4），NIA1誘餌菌株在400 ng/mL的AbA濃度下已無菌落生長。因此，最終文庫篩選時NIA1誘餌菌株所用培養基的AbA濃度為400 ng/mL。

2.4 煙草K326 cDNA文庫構建結果

煙草cDNA文庫電泳鑒定結果（圖5）中可以看出，條帶呈彌散狀且分布均勻，表明煙草全基因歸一化表達文庫構建成功，可以用于酵母單雜交實驗篩選。

圖3 陽性誘餌菌株的鑒定Fig.3 Identification of positive bait colony

圖4 AbA最低抑制濃度的鑒定Fig.4 Identification of the minimum inhibitory concentration of AbA

圖5 cDNA文庫電泳圖Fig.5 Electrophoretic diagram of cDNA library

2.5 酵母單雜交文庫互作蛋白的初步篩選結果

酵母但雜交文庫總克隆數為4.6×106（圖6），滿足要求。對陽性克隆進行菌落 PCR，結果表明（圖7）插入片段長度分布在200 bp ～ 2000 bp之間，說明構建的文庫容量和質量符合要求。

將上述PCR產物測序進行同源性比對，篩選出 9個有生物學意義的基因序列（表1），并分別對其進行電泳驗證（圖8）。

圖6 文庫篩選菌落生長情況Fig.6 Colony growth oflibrary screening

圖7 NIA1啟動子區域酵母單雜交篩庫部分備選菌落的PCR結果Fig.7 PCR results of certain colonies in yeast one hybrid library of NIA1 promoter region

圖8 NIA1啟動子片段酵母單雜交文庫篩選結果Fig.8 Screening results of NIA1 promoter fragment in yeast one hybrid library

表1 NIA1啟動子序列轉錄因子篩選結果Tab.1 NIA1 promotor transcription factor screening results

3 討論

本研究利用Clontech公司提供的酵母單雜交文庫篩選系統構建了硝酸還原酶基因NIA1啟動子區域的酵母單雜交文庫，并篩選出 9 個來自煙草屬的基因序列。其中，功能較為明確的蛋白有2個，分別是含有CRM（The chloroplast RNA splicing and ribosome maturation）結構域的CFM3蛋白（No.71）和亞硫酸鹽氧化酶類似蛋白（No.126，Sulfite oxidase-like，SO）。其余蛋白功能尚不明確，但通過其結構域可對部分蛋白的功能進行推測。如No.51是未知線粒體類似蛋白、No.68含有胃蛋白酶類似結構域等。No.95是CMSS1轉錄變異體，含有p-環NTP酶結構域，其特點是具有Walker A和Walker B基序，可以分別與核苷酸的磷酸基團和Mg2+結合，目前研究已知P環NTP酶類在植物抗病方面發揮了重要作用[17]。

篩選得到的No.71（XP_016503563.1）蛋白與煙草中的預測蛋白CFM3有同源性，含有CRM結構域。已有研究發現，植物葉綠體中含有CRM結構域的蛋白能夠與RNA結合，并參與對內含子的剪接[16]。RNA結合蛋白往往在基因表達的轉錄后調控中扮演重要角色，某些具有特殊結構的RNA結合蛋白也可作為轉錄因子與DNA結合[17]。有研究指出，CRM結構域也許能夠在一定程度上特異地與催化性RNA互作[18]。目前已發現CFM3蛋白不僅作用于葉綠體group II內含子的剪接，也參與了線粒體基因的表達及其他一些植物和細菌的生命過程[19]。因此，煙草CFM3類似蛋白也有可能以某種形式參與了煙草NIA1啟動子的轉錄調控。

No.126（NP_001312236.1）是普通煙草中的亞硫酸鹽氧化酶類似蛋白SO。SO是如今發現的4種鉬酶中分子量最小的一種，其 N 端含有鉬輔因子（molybdenum cofactor，Moco）結構域，在高等植物種廣泛分布且高度保守。有研究認為，植物的SO和NR有相當大的同源性，說明它們可能來自于一個共同的家族[20]。植物SO定位于植物過氧化物酶體，研究發現所有SO蛋白質的C端都含有一個過氧化酶體定位序列（peroxismal targeting sequence，PTS）[21-22]，試驗表明，PTS 能夠引導多肽進入植物、動物和酵母的過氧化物酶體中。但其對硝酸還原酶基因的轉錄表達調控的影響尚需進一步研究。