草魚高脂日糧磷酸二氫鈣適宜添加量的研究

李戰福 羅金強 楊慧施 羅 浩, 李 玉 陳擁軍 羅 莉

(1. 西南大學動物科技學院, 淡水魚類資源與生殖發育教育部重點實驗室, 重慶 400715;2. 北京師范大學統計學院, 北京 100875; 3. 新希望六和股份有限公司, 成都 610041)

磷是魚類生長必需的常量礦物元素之一, 是骨骼、齒和鱗的組成成分, 能直接參與細胞中產生能量的各種反應, 與體內脂肪代謝有著強相關性[1, 2]。在脂類代謝過程中, 通常以磷脂的形式參與脂類物質和脂溶性維生素的代謝過程, 具有提高飼料中脂肪的氧化代謝速率, 加快營養物質的吸收, 促進魚類生長的同時減少體內脂肪沉積的作用[3]。由于水體磷含量和魚對飼料原料磷的利用率較低, 一般需在飼料中添加無機礦物磷來滿足魚類對磷的需求,以達到改善魚體的生長及健康狀況的目的。對于無胃的鯉科魚類, MCP是最為高效和經濟的磷源,且在草魚飼料中添加磷酸二氫鈣的效果優于其他無機磷源[3, 4]。

草魚(Ctenopharyngodon idella)屬鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae)、草魚屬(Ctenopharyngodon), 是我國重要的淡水養殖經濟魚類, 其養殖產量、飼料需求量占居第一位。隨集約化高密度養殖的推廣, 常通過增加飼料脂肪水平來達到提高養殖品種的生長速率、節約蛋白和提高飼料轉化率的目的[5, 6]。而實際養殖生產中適量提高飼料脂肪水平是否意味著磷的添加量應適當的增加是一個值得探討的問題。迄今, 國內外關于魚類對磷需要量的研究已有大量報道, 主要淡水養殖品種的磷需要量為0.5%—1.57%, MCP的添加量為0.8%—3.6%[3, 7—10]。但因磷的添加量評定多采用純化或半純化日糧, 脂肪多設置在較低水平, 而在實際生產中飼喂的是較高脂肪水平的實用飼料, 其能量原料、蛋白原料和磷源礦物質原料可利用磷參數并不全面, 對磷的添加仍存在不確定性。目前, 唯有肖順應[3]研究指出, 草魚幼魚飼料中MCP適宜添加量為1.2%。然而, 由于該研究中脂肪設置在較低水平(CL2.3%), 故草魚實用高脂飼料中磷添加量需重新評定。為了使養殖魚類達到較好的生長效果并盡量減少對環境的污染, 對草魚高脂實用飼料中MCP的添加研究有很重要的意義。

鑒于此, 本研究在草魚高脂(7.0%)日糧中分別添加0、1.0%、2.0%、3.0%和4.0%的MCP, 探討其對草魚生長性能、抗氧化及脂質代謝的影響, 確定草魚高脂日糧中MCP的適宜添加量, 同時提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗魚及飼養管理

試驗草魚購于重慶市長壽魚種場, 經3.0%濃度食鹽水消毒后在室內養殖缸(392 L)中暫養, 用商品飼料(CP32%, CL5%, 重慶大發飼料有限公司)進行2周馴化。正式試驗前, 選擇體質健壯、體質量為(105.23±0.55) g的草魚, 隨機分為5個處理組, 每組3個重復, 每組15尾魚, 日投喂量為體質量的2%—4%, 每天投喂3次(8:30、12:30、17:30), 生長試驗為8周。據試驗魚的增重情況, 期間每隔10天調整1次投喂量。飼養期間水溫為(22.0±2.5)℃, 溶氧量(6.5±0.4) mg/L, 氨氮＜0.1 mg/L, 亞硝酸鹽＜0.1 mg/L,硫化氫＜0.05 mg/L, pH為 (6.7±0.3)。

1.2 試驗配方

本試驗采用全植物蛋白飼料(豆粕、菜粕和棉粕)為蛋白源、大豆油作為脂肪源制成試驗日糧,其組成及營養成分分析見表 1。日糧采用單因子濃度梯度法設計, 在基礎飼糧中分別添加0 (對照)、1.0%、2.0%、3.0%和4.0%的MCP (四川川恒化工股份有限公司小太子牌, 磷含量19.09%, 實測), 分別表示為MCP0% (TP0.80%)組、MCP1.0%(TP1.02%)組、MCP2.0% (TP1.22%)組、MCP3.0%(TP1.44%)組和MCP4.0% (TP1.66%)組。為保持試驗日糧中鈣含量一致, 配方先經氯化鈣(CaCl2)調平后用膨潤土相應配平至100.00%, 配制成5種試驗日糧, 飼料原料全部過40目篩, 采用逐級稀釋法混合,擠壓制成直徑2.0 mm的顆粒, 風干分裝, -20℃保存備用。

1.3 樣品采集和分析方法

樣品采集養殖試驗結束后試驗魚停食24h,每組隨機選取8尾魚, 用MS-222進行麻醉后, 分別測其體高、體長、稱重。取5尾魚在冰盤上解剖,取出內臟團并分離肝胰臟和腸道, 內臟團和肝胰臟稱重, 腸道用濾紙吸干表面水分, 剪碎混勻后用液氮速凍, 置于-80℃冰箱中用于消化酶測定。另3尾魚靜脈取血, 4℃靜置3h后, 4℃冷凍離心(4000 r/min, 10min), 取血清-80℃保存備用, 用于血液生化指標的測定。

常規成分分析飼料原料及成品、全魚、肌肉、肝臟常規成分的測定方法: 水分、粗蛋白、粗脂肪、粗灰分含量, 分別采用105℃烘箱干燥法(GB/T 6435—2006)、凱氏定氮法(GB/T 6432—1994)、索氏抽提法(GB/T 6433—1994)、550℃灼燒法(GB/T 6438—1992)進行測定; 磷的測定方法:飼料總磷(GB/T 6437—2002)。

生長及形體指標測定準確稱取每缸魚體質量和剩余飼料, 各生長及形體指標計算公式如下:(Wt-W0);

表 1 實驗日糧配方及其營養組成(風干樣基礎)Tab. 1 Formulation and proximate analysis of experimental diets(air-dry basis) (%)

內臟指數(Viscerosomatic index,VSI, %)=Wv/W×100%;

肥滿度(Condition factor,CF, g/cm3)=W/L3×100%;

式中:W0為初始魚尾重(g);Wt為終末魚尾重(g);F為尾均攝食量(g);L為魚體長(cm);W為魚體重(g);Wv為內臟重(g)。

消化酶及血液生化指標的測定腸道淀粉酶(Amylase)、脂肪酶(Lipase)、胰蛋白酶(Trypsin),血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、總抗氧化能力(T-AOC) 、堿性磷酸酶(AKP)、谷丙轉氨酶(ALT), 肝臟丙二醛(MDA)等指標均采用試劑盒(南京建成生物工程研究所) 并按照規定方法測定。肝臟肉堿脂酰轉移酶(CPT-Ⅰ)和乙酰輔酶A羧化酶(ACC)采用試劑盒(上海江萊生物科技有限公司) 并按照規定方法測定。

1.4 數據處理

試驗數據均采用統計軟件SPSS 22.0分析。經過單因素方差分析(One-way ANOVA)之后, 采用Duncan’s多重比較,P＜0.05表示差異顯著。實驗數據均用平以均值±標準差表示, 折線回歸模型[Y=L-U(R-XLR),XLR表示X＜R, 當X＞R時, (R-XLR)=0][12]來分析飼料中MCP的適宜添加量。

2 結果

2.1 高脂日糧中MCP添加水平對草魚生長性能和形體指標的影響

隨日糧中MCP添加水平的增加, 草魚FBW與WGR顯著上升, 其中3.0%組WGR比對照組升高了135.40% (P＜0.05), 當添加量大于3.0%后差異不顯著(P＞0.05), 而FCR和VSI逐漸下降, 分別在3.0%和4.0%組達到了最小值,而 4.0%組VSI較0組降低了23.06%。2.0%和3.0%組CF顯著高于其他組(P＜0.05, 表 2)。

采用折線模型擬合WGR(Y1)、FCR(Y2)和MCP添加水平(X)之間的關系, 分別得到高脂日糧中滿足草魚最佳生長需求和最低FCR的MCP添加量為3.26% [Y1=92.4-17.579 (3.26-X),R2=0.948]和2.96%[Y2=1.54+0.307 (2.96-X),R2=0.950](圖 1、圖 2)。

2.2 在高脂日糧中MCP添加水平對草魚營養組成的影響

隨著日糧中MCP添加水平增加, 草魚全魚粗蛋白和肌肉粗蛋白顯著上升, 在3.0%組水平達到最大值(P＜0.05), 而全魚、內臟、肝臟和肌肉粗脂肪隨日糧中磷含量增加而顯著下降, 在3.0%組達到最小值(P＜0.05), 較0組降低了13.71%。全魚粗灰分在0—3%水平組有增加趨勢但差異不顯著(P＞0.05);而全魚總磷在0—2.0%水平組逐漸升高, 在2.0%—4.0%水平組差異不顯著(P＞0.05, 表 3)。

采用折線模型擬合全魚磷含量(Y3) 和MCP添加水平(X)之間的關系, 得到滿足草魚對磷最大沉積需要的飼料MCP最低添加量為2.63%[Y4=1.83-0.228 (2.63-X),R2=0.925 (圖 3)]。

2.3 在高脂日糧中MCP添加水平對草魚血清生化指標的影響

日糧中MCP添加水平對草魚血清TG、TC、AKP和ALT均有顯著影響(P＜0.05)。其中MCP添加組中血清TG顯著低于對照組(P＜0.05), 但MCP添加組之間差異不顯著(P＞0.05)。而血清TC隨日糧中添加磷的增加顯著下降, 添加量大于3.0%后急劇上升, 其血清TG和TC均在3.0%組達到最小值。當MCP添加水平從0上升至4.0%時, 血清AKP活性先增后降, 3.0%組最高, 較0組上升了100.66%。而血清ALT活性與血清AKP活性相反, 其中3.0%組顯著低于其他組(P＜0.05), 較0組下降了47.83% (表 4)。

表 2 在高脂日糧水平下MCP添加水平對草魚生長性能和形體指標的影響Tab. 2 Effects of different MCP levels on the growth performance and body index of grass carp with high lipid diet

2.4 在高脂日糧中MCP添加水平對草魚消化及抗氧化能力的影響

日糧MCP添加水平對草魚腸道消化酶活性及抗氧化能力均有顯著影響(P＜0.05)。腸道淀粉酶和脂肪酶活性隨日糧MCP添加水平從0上升至4.0%時顯著上升, 均在4.0%水平達到最高(P＜0.05), 與0組相比分別升高了270.21%和70.77%, 而腸道胰蛋白酶活性呈先上升后下降趨勢, 最大值出現在3.0%,較0組升高了8.42% (P＜0.05)。這說明日糧中添加適宜的MCP對淀粉和脂肪的消化能力的提升遠高于蛋白質。當MCP添加水平從0上升到4.0%時, 血清T-AOC含量呈上升趨勢, 在4.0%水平達到最高, 較0組升高了175.90%, 而肝臟MDA含量則呈先下降后上升的趨勢, 在3.0%水平達到最小值(P＜0.05, 表 5)。

2.5 在高脂日糧中MCP添加水平對草魚肝臟脂質代謝的影響

在日糧中添加不同水平MCP對草魚肝臟脂質代謝酶活性有顯著影響(P＜0.05)。當MCP添加水平從0上升至4.0%時, 肝臟CPT-1活性呈上升的趨勢,在4.0%組達到了最大值(P＜0.05), 較0組升高了30.80%。肝臟ACC活性呈先下降后上升的趨勢, 在3.0%達到最小值(P＜0.05), 較0組下降了36.66%。隨日糧磷添加量的增加, 對肝臟CPT-I/ACC活力比值有顯著影響(P＜0.05), 在0—4.0%時CPT-I/ACC比值先增后降, 在MCP3.0%組達到最大 (表 6)。

圖 1 MCP添加水平對增重率的影響Fig. 1 Effects of dietary MCP levels on the WGR

2.6 日糧MCP添加水平相關指標間的相關性分析

將隨著日糧MCP水平的變化的指標2(增重率,全魚、內臟、肝臟和肌肉粗脂肪, 腸道脂肪酶)與指標1(MCP水平) , 指標4 (TC、TG、CPT-I/ACC、CPT-I和ACC)與指標3 (全魚和肝臟粗脂肪)之間進行相關性分析后, 發現全魚、內臟和肌肉脂肪,FCR與MCP水平, TC、TG和與全魚粗脂肪均呈顯著二次曲線相關(P＜0.05);WGR、腸道脂肪酶活性與MCP水平和ACC活性與肝臟粗脂肪呈顯著正相關, CPT-I/ACC比值與全魚粗脂肪呈顯著負相關(P＜0.05); 而肝臟粗脂肪與MCP、CPT-I與肝臟粗脂肪存在一定的線性相關關系(P＞0.05, 表 7)。

3 討論

3.1 高脂日糧添加適宜MCP對草魚生長性能的改善

圖 2 MCP添加水平對飼料系數的影響Fig. 2 Effects of dietary MCP levels on the FCR

表 3 在高脂日糧水平下MCP添加水平對草魚營養組成的影響(干物質基礎)Tab. 3 Effects of different MCP levels on the nutrient composition of grass carp with high lipid diet (dry matter basis)

圖 3 MCP添加水平對全魚磷含量的影響Fig. 3 Effects of dietary MCP levels on whole-body phosphorus

磷是魚類營養的重要元素, 攝食含磷量不同的飼料會導致魚體生長性能及飼料效率發生變化[3]。磷添加不足會造成水產動物生長速率緩慢、飼料利用率下降和骨骼發育不良, 而過量又會導致魚類代謝紊亂、增加飼料成本和污染水體等[7, 8, 11]。本實驗結果表明, 磷的添加可顯著影響草魚的生長性能, 除此之外, 磷添加過低還表現在體脂肪和組織脂肪蓄積, 消化能力下降以及機體抗氧化能力降低等, 但未出現骨骼發育異常等缺乏癥狀, 這可能是由于基礎原料中所含磷能夠滿足草魚基本生長需要和骨骼的正常發育, 而磷添加過量會導致魚類代謝紊亂增加脂肪沉積和飼料成本。評價魚類飼料中磷適宜添加量的指標很多, 并且不同的指標評定出的結果有所差異。為使養殖魚類達到較好生長效果并盡量減少對環境的污染, 本研究以WGR和FCR為觀測指標, 折線模型分析得日糧MCP適宜添加水平為2.96%—3.26% (總磷TP為1.43%—1.50%)。這一結果與Yuan等[13]胭脂魚(Myxocyprinus asiaticus)結果相近, 而高于肖順應[3]研究的草魚(1.2%)和湘云鯽(Triploid crucian carp)[14]、建鯉[10](Cyprinus carpiovar. Jian)、鯉(Cyprinus carpioL.)[15]、吉羅羅非魚(Oreochromis niloticus)[16]等。本研究相較于前人對草魚磷需求量研究所得結果要高, 其原因可能是與本試驗磷添加量評定采用的是高脂實用日料, 而前人研究多采用純化或半純化日糧, 脂肪多設置在較低水平有關, 這也進一步說明了適量提高日糧脂肪水平, 磷的添加量應適當的增加, 可見日糧磷同樣影響草魚的脂肪代謝。不同魚類最適磷添加量的差異可能是由于種類、規格、生長階段、日糧構成、磷源以及養殖環境等不同所致[17]。

表 4 在高脂日糧水平下添加不同MCP對草魚血清生化指標的影響Tab. 4 Effects of different MCP levels on grass carp serum biochemical index with high lipid diet

表 5 在高脂日糧水平下添加MCP對草魚消化及抗氧化能力的影響Tab. 5 Effects of different MCP levels on intestinal digestive and antioxidant ability of grass carp with high lipid diet

表 6 高脂日糧水平下添加MCP對草魚肝臟脂質代謝酶活性的影響Tab. 6 Effect of different MCP levels on lipid metabolism enzymatic activity of liver of grass carp with high lipid diet

3.2 高脂日糧添加適宜MCP對草魚脂質消化、代謝及沉積的影響

關于磷的添加對魚類脂肪消化吸收、肝臟脂肪酸合成與分解代謝及沉積的影響研究已有部分報道。肝胰臟是魚類進行脂肪代謝和調節脂肪蓄積的主要器官, 也是生成脂肪酶的主要器官, 而腸道是無胃魚主要的消化、吸收營養物質的場所。脂肪的運輸主要借助血清, 血清中的總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)的含量在一定程度上代表著全身的脂類代謝程度[18—20]。本研究表明, 在高脂日糧中添加適宜的磷時顯著提高了草魚腸道脂肪酶的活性, 促進了脂質的消化, 降低了草魚血清TC和TG, 與EI-Zibdeh等[19]在大黃魚中的研究結果一致,大黃魚血清中TC和TG含量隨飼料中磷水平的升高而降低, 表明在飼料中適量磷的添加有利于改善草魚的肝臟脂肪代謝。肉堿脂酰轉移酶-Ⅰ(CPT-Ⅰ)是線粒體肉堿轉運系統重要組成酶, 是脂肪酸分解酶中的關鍵限速酶, 在能量代謝中起著重要作用, 長鏈脂肪酸及其輔酶A只有通過該轉運系統才能進入線粒體基質進行β氧化, 而乙酰輔酶A羧化酶(ACC)是脂肪酸從頭合成途徑的關鍵限速酶。Sugiura等[21]在虹鱒的研究中發現, 飼喂高低2種不同磷水平的飼料, 肝臟CPT-I表達量沒有顯著差異, 但是肝臟ACC表達量在高磷飼料組顯著下降。石亞慶[14]在湘云鯽的研究發現, 肝臟ACC活性隨飼料MCP添加水平的升高呈先降低后上升的趨勢。本試驗肝臟ACC活性呈先下降(MCP0—3.0%)后上升(MCP3.0%—4.0%)趨勢, 而肝臟CPT-1活性隨磷添加水平的增加逐漸升高, 其中MCP3.0%組CPT-I與ACC比值最大, 說明添加量脂肪酸的分解代謝速率高于脂肪酸合成速率, 使得草魚肝脂下降。Takeuchit等[22]認為發生變化的原因可能是因為魚體攝取飼料磷的數量與體內脂肪的氧化速度存在聯系有關,Roy等[23]認為可能是因為攝食高磷水平飼料的魚體內, 脂肪酸的氧化增強, 糖原生成增加, 導致蛋白沉積的增加和脂肪沉積的降低。

魚類攝食含磷量不同的日糧會直接影響魚體常規成分。在本試驗日糧中磷的添加與脂肪沉積關系表現在添加量不足或過量組中全魚、內臟、肝臟和肌肉中脂肪含量均顯著高于適宜添加組(P＜0.05)。Eya等[24]研究發現, 斑點叉尾鮰肌肉中脂肪含量與飼料中磷含量之間呈負相關關系, 而蛋白含量與飼料磷含量之間呈正相關關系。這也進一步驗證在日糧中添加適宜磷可顯著減少脂肪沉積。綜上, 在日糧中添加適宜的MCP可以促進草魚腸道脂肪消化吸收, 加快肝臟脂肪酸合成與分解代謝速率, 從而減少魚體脂肪沉積, 其深入機理有待進一步探討。

3.3 高脂日糧添加適宜MCP對草魚抗氧化能力的影響

需氧生物體在糖脂代謝過程中會產生大量自由基(Free radical, FR), 線粒體呼吸鏈電子漏生成的超氧陰離子是有機體活性氧的主要和恒定來源, 其中作用最廣的氧自由基有超氧自由基羥自由基(OH·)和過氧化氫(H2O2)[19, 25]。自由基的過度產生是機體過氧化損傷、代謝紊亂和抗氧化失衡的主要原因。磷脂是構成生物膜的重要部分, 因富含多不飽和脂肪酸故極易受自由基破壞, 膜中磷脂發生過氧化作用, 會引起膜中蛋白質及酶的交聯或失活, 導致膜通透性的變化, 嚴重影響膜的各種生理功能。若細胞內線粒體膜被氧化受損, 則會使能量生成系統受到影響, 從而引起細胞功能極大紊亂[20, 26]。總抗氧化能力(T-AOC)是一個用于衡量生物機體抗氧化系統狀況的綜合性指標, 它可以在一定程度上反映出機體自由基代謝的情況。丙二醛(MDA)是脂質過氧化反應的最終代謝產物, 其含量的高低可以間接反映機體脂質過氧化水平。李安林等[27]研究表明高脂飼料磷添加不足可導致大鼠T-AOC顯著降低, MDA含量顯著升高。而本研究在高脂日糧中添加適宜磷后顯著升高草魚T-AOC,降低肝臟中MDA含量, 這與Feng等[28]和Tang等[29]分別在磷對建鯉和鯰魚的抗氧化能力影響的研究得出的結果相似。可能與磷是構成細胞膜磷脂的主要成分, 在飼料中添加適量的磷能保證細胞膜的完整性, 降低一些超氧化物的侵襲有關。堿性磷酸酶(AKP)是磷代謝過程中的調控酶, 而谷丙轉氨酶(ALT) 是反映肝細胞受損程度最靈敏的指標, 在肝細胞受到損傷時, ALT釋放入血液中, 會引起血清ALT偏高。本試驗表明在MCP3%組時, AKP活性最高, 而ALT活性最低, 這與陳任孝[30]在吉富羅非魚上的研究結果相似, 說明在日糧中添加適量MCP能促進AKP活性, 進而增強磷代謝利用以及對肝臟有一定的保護作用。AKP作為磷代謝的重要酶, 它受日糧等因素影響的變化范圍有待進一步的確定, 為后續的研究提供更多的依據。

表 7 高脂日糧MCP添加水平與體組織脂肪及脂質消化和代謝指標間的相關性分析Tab. 7 The correlations between dietary MCP supplementation and body, tissue fat, lipid digestion and metabolism indices

4 結論

在本試驗條件下, 得出草魚日糧在脂肪水平為7.0%時磷酸二氫鈣(MCP)適宜添加量為2.96%—3.26%, 即飼料總磷量為1.43%—1.50%。該添加水平能提高魚體對飼料中淀粉和脂肪的消化吸收, 加快營養物質的吸收, 增加糖原生成, 減少體內脂肪蓄積, 并提高抗氧化能力, 從而促進魚體生長。