三疣梭子蟹UHRF1基因在胚胎、幼體和性腺發育過程中的表達分析

蔡 影 孟憲亮 劉 萍, 李 健 環朋朋 孫東方

(1. 中國水產科學研究院黃海水產研究所, 農業部海洋漁業可持續發展重點實驗室, 青島 266071; 2. 青島海洋科學與技術國家實驗室, 海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室, 青島 266235; 3. 上海海洋大學水產與生命學院, 上海 201306)

表觀遺傳是指由非DNA序列改變引起的、可遺傳的基因表達改變, 它主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、RNA調控和染色質重塑等現象[1]。大量研究表明, 表觀遺傳在真核生物的生長、發育、生殖等生命過程中都發揮著重要的作用[2]。

泛素樣含PHD和環指域蛋白1(UHRF1)是近年來新發現的一種核蛋白, 被認為是表觀遺傳的核心蛋白, 是連接DNA甲基化和組蛋白修飾的重要紐帶, 能夠通過其特殊的結構域識別表觀遺傳學標記并結合相應的催化酶, 調控DNA甲基化[3]、組蛋白甲基化和組蛋白乙酰化[4, 5]等表觀遺傳修飾的水平。研究表明,UHRF1在脊椎動物發育編程中發揮重要作用。UHRF1表達異常能夠造成個體發育缺陷, 甚至死亡。敲除UHRF1能夠使斑馬魚(Danio rerio)胚胎的整體甲基化水平顯著降低, 進而導致胚胎肝臟、眼等發育缺陷, 胚胎發育至幼體階段便死亡[6]。在哺乳動物中的研究發現,UHRF1在配子發生過程中, DNA甲基化水平的維持具有重要作用[7]。UHRF1突變小鼠的卵母細胞DNA甲基化水平顯著低于正常小鼠, 雖然卵母細胞的發育并未受到影響, 但大部分卵細胞受精發育到囊胚期之前便已死亡[8]。

UHRF1在脊椎動物中研究廣泛, 但在甲殼動物中還未見相關報道。三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是我國重要的海水養殖經濟蟹類。為探討PtUHRF1基因在三疣梭子蟹發育過程中的作用, 本實驗采用SMART RACE方法克隆了三疣梭子蟹PtUHRF1基因cDNA全長并分析了其結構特征。采用實時定量技術, 檢測了PtUHRF1基因在三疣梭子蟹胚胎時期、幼體時期和性腺發育時期表達情況,研究結果為進一步深入探討PtUHRF1在三疣梭子蟹及甲殼動物中的發育調控提供重要依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與取樣

實驗所用三疣梭子蟹取自本實驗室昌邑實驗基地。選取附肢完整的三疣梭子蟹, 體重為25—250 g, 甲寬為42.51—90.94 mm。在室內養殖池中用自然海水暫養7d。水溫為(21±2)℃, 鹽度為33, 每天定時換海水1/3, 清理池底, 定時投喂藍蛤, 不間斷充氧氣。

2016年7月到2017年4月, 在實驗基地連續采集三疣梭子蟹卵巢和精巢發育不同時期的樣品以及早期胚胎、溞狀幼體、大眼幼體樣品。每個時期設置3個重復。樣品采集2份, 一份保存于液氮中,另一份采用4%多聚甲醛固定。根據管衛兵等[9]和吳旭干等[10]對三疣梭子蟹精、卵巢分期的方法, 對采集精巢和卵巢樣品初步分期, 從分期的每組樣品中選取7個樣品切片、HE染色, 在顯微鏡下觀察性腺的組織學特征(圖版Ⅰ), 根據葉海輝等[11]和吳旭干等[10]對精巢、卵巢分期的方法來最終確定精巢、卵巢的發育成熟時期。

1.2 實驗方法

三疣梭子蟹總RNA的提取和RACE模板的合成利用Trizol試劑提取肌肉、卵巢、胃、精巢、肝胰腺、鰓、腸、胸腺等組織總RNA, 采用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的RNA質量以及完整性。選取其中質量較好的卵巢總RNA, 按照SMART RACE Amplification Kit 說明書的方法合成3′和5′ RACE 模板。

三疣梭子蟹PtUHRF1基因cDNA全長克隆根據三疣梭子蟹性腺轉錄組數據中UHRF1基因片段序列, 使用primer3在線引物設計軟件設計UHRF1的3′和5′端特異性引物(表 1)。使用TaKaRa LATaq酶、RACE通用引物UPM、NUP, 采用巢式擴增,兩輪PCR。PCR擴增程序: 94℃ 5min, 94℃ 30s,60℃ 30s, 72℃ 2min, 72℃ 10min 4℃保存, PCR產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳、DNA回收試劑盒回收得到擴增的目的片段, 紫外分光光度計檢測回收DNA濃度, 用pMD18-T載體連接所得目的片段, 10 μL體系程序為16℃, 3h。連接液轉入DH5α感受態中,于冰上放置40min后熱激45s, 加入1 mL LB, 37℃搖床培養50min, 100 μL涂于氨芐抗性的培養板上,37℃過夜, 挑菌搖床培養, M13引物檢測菌液PCR,瓊脂糖電泳檢測并送電泳條帶大小合適的測序。

1.3 PtUHRF1基因的組織表達分析

采用Trizol方法提取三疣梭子蟹肌肉、卵巢、精巢等組織以及性腺、胚胎、幼體各時期總的RNA, 參照PrimeScript RT reagent Kit說明書反轉錄合成20 μL體系cDNA。

根據三疣梭子蟹PtUHRF1基因的開放閱讀框(ORF)設計一對熒光定量引物(UHRF1-F1、UHRF1-R1)以及一對內參引物(β-actin-F、β-actin-R), 使用ABI 7500 Real Time PCR儀和TaKaRa SYBR Premix ExTaqⅡ試劑分析PtUHRF1基因在三疣梭子蟹性腺、胚胎、幼體不同發育時期以及組織分布表達情況。反應體系參照TaKaRa SYBR Premix ExTaqⅡ說明書, 10 μL反應體系包括: 5 μL SYBR Premix ExTaqⅡ (2×)、0.4 μL的正反向引物、3.0 μL DEPC水、0.2 μL ROX Reference DyeⅡ (50×)、1.0 μL cDNA。反應程序: 95℃ 30s; 95℃5s, 60℃ 30s, 40個循環; 95℃ 15s, 60℃ 1min, 95℃15s。PtUHRF1基因相對表達分析采用2-ΔΔCt法, 用SPSS19.0進行單因素方差分析, Origin2016作圖。

表 1 實驗引物序列Tab. 1 Primer used in this study

1.4 PtUHRF1基因的生物信息學分析

使用DNAstar拼接軟件將測序得到目的序列和三疣梭子蟹PtUHRF1基因的EST序列拼接得到PtUHRF1基因的序列全長。用DNAstar中的Edit-Seq或在線軟件ORFfinder預測PtUHRF1基因的開放閱讀框(ORF)并進行氨基酸翻譯, 用NCBI Blastx軟件分析PtUHRF1基因和其他物種相似性,SingalP4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) ExPASy、NCBI Conserved damain (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)等在線軟件預測PtUHRF1基因的分子量和等電點以及分析其蛋白質功能結構域。將從GenBank中下載的其他物種的UHRF1氨基酸序列同三疣梭子蟹PtUHRF1氨基酸序列, 采用MEGA4.0軟件構建PtUHRF1氨基酸NJ系統進化樹。

2 結果

2.1 PtUHRF1基因的cDNA全長及序列同源性分析

三疣梭子蟹PtUHRF1基因全長為2849 bp,GenBank登錄號為MG734836, 3′和5′ UTR分別為410和141 bp, 開放閱讀框(ORF)長2298 bp, ORF編碼765個氨基酸, 預測PtUHRF1表達蛋白的分子量86.72 kD, 理論等電點是8.37, PtUHRF1氨基酸序列。PtUHRF1具有UBL、TTD、PHD、SRA、RING finger 5個結構域(圖 1)。通過在線Blastp對比不同物種UHRF1基因氨基酸序列, 結果顯示, PtUHRF1氨基酸序列保守性相對較高, 三疣梭子蟹編碼的氨基酸序列和桃蚜(Myzus persicae)的同源性為55%。利用MEGA4.0軟件采用鄰接法構建三疣梭子蟹PtUHRF1系統進化樹, 結果顯示三疣梭子蟹PtUHRF1同桃蚜(M. persicae)UHRF1進化關系最近聚為一支, 再和茶翅蝽(Halyomorpha halys)和煙粉虱(Bemisia tabaci)聚為一支(圖 2)。

2.2 PtUHRF1基因在三疣梭子蟹胚胎時期和幼體時期的表達分析

在早期胚胎發育階段,PtUHRF1基因呈現先下降后上升的趨勢, 在受精卵時期的表達顯著高于其他時期(P＜0.05), 是多細胞時期表達量的2.5倍(圖3)。在幼體時期,PtUHRF1的表達呈現先上升后下降的趨勢, 在蚤狀幼體Ⅱ和大眼幼體第3天,PtUHRF1的表達量最高并且顯著高于同一時期的其他組織(P＜0.05)(圖 4)。

2.3 PtUHRF1基因在三疣梭子蟹中組織分布以及在性腺不同時期表達分析

圖 1 三疣梭子蟹PtUHRF1蛋白結構域位置Fig. 1 The sites of domains in PtUHRF1 in P. trituberculatus

圖 2 基于UHRF1氨基酸序列構建的NJ進化樹Fig. 2 NJ tree based on UHRF1 amino acid sequences

圖 3 PtUHRF1基因在三疣梭子蟹胚胎時期的表達Fig. 3 Expression of PtUHRF1 in embryonic development ofPortunus trituberculatus

圖 4 PtUHRF1基因在三疣梭子蟹蚤狀幼體和大眼幼體時期的表達Fig. 4 The expression of PtUHRF1 in zoea and megalops larva of Portunus trituberculatus

利用Real-time PCR技術, 我們分析了PtUHRF1基因在不同組織和性腺中的表達情況, 結果表明,PtUHRF1基因在所有的組織中均有表達, 精巢中的表達量顯著高于其他組織(P＜0.05), 肌肉次之, 接下來依次是心臟、卵巢、眼柄、肝胰腺、胸腺、腸、胃和腦神經(圖 5)。對三疣梭子蟹卵巢不同時期的表達分析顯示,PtUHRF1的表達量呈現先上升后下降的趨勢, 在卵巢發育Ⅱ期的表達量顯著高于其他時期(P＜0.05), 是最低Ⅲ期的2倍(圖 6)。而在精巢中,PtUHRF1的表達量則呈現逐漸遞減的趨勢, 在I期的表達量顯著高于其他時期(P＜0.05), 其表達量是最低Ⅲ期的4.5倍(圖 7)。

3 討論

3.1 PtUHRF1基因 cDNA 全長克隆及序列分析

本實驗克隆了三疣梭子蟹PtUHRF1基因, 該基因cDNA全長為2849 bp, 編碼765個氨基酸。該基因編碼的蛋白質包含典型的UHRF1功能結構域, 包括UBL(Ubiquitin-like domain)結構域、TTD(Tandem tudordomian)結構域、PHD(Plant homeodomain)結構域、SRA(SET and Ring-associated domain)結構域和RING(Really interesting new gene)結構域。其中, PHD和TTD功能域能夠識別并參與修飾常染色質和異染色質中的組蛋白[12]; SRA(SET和RING)功能域能夠識別半甲基化的CpG位點, 在DNA復制時, 能夠募集甲基轉移酶1(Dnmt1)維持新合成的DNA半甲基化狀態[5]; UBL與RING結構域擁有泛素連接酶的活性, 可以特定泛素化包括細胞周期相關蛋白等重要代謝因子[13],PtUHRF1的結構特征暗示其很有可能在三疣梭子蟹的表觀遺傳調控中發揮重要作用。

圖 5 三疣梭子蟹PtUHRF1基因在不同組織中的表達分布Fig. 5 The expression of PtUHRF1 in different tissues of Portunus trituberculatus

圖 6 三疣梭子蟹PtUHRF1基因在卵巢發育不同時期的表達Fig. 6 The expression of PtUHRF1 in ovary of Portunus trituberculatus in different gonadal stages

圖 7 三疣梭子蟹PtUHRF1基因在精巢發育不同時期的表達Fig. 7 Expression of PtUHRF1 gene in testis of Portunus trituberculatus in different gonadal stages

3.2 PtUHRF1基因在性腺發育不同時期表達分析

已有研究表明, 表觀遺傳修飾在配子發生中發揮重要的作用[7, 8], 如參與基因組印記的維持, X-染色體的失活等[14, 15]。UHRF1能促進小鼠配子發生過程中DNA甲基化的維持[8],UHRF1突變小鼠卵細胞Dnmt1的表達明顯下調, 卵細胞整體甲基化水平明顯下降, 導致胚胎無法正常發育[8]。組織分布和性腺表達分析結果顯示,PtUHRF1在三疣梭子蟹所有組織中均有表達, 但在不同組織中表達差異顯著,其在精巢中表達量最高(P＜0.05), 表明該基因可能在三疣梭子蟹精子發生過程中具有重要作用。性腺不同發育時期表達分析結果顯示,PtUHRF1基因在三疣梭子蟹卵巢發育不同時期表達差異顯著, 其在Ⅱ期和Ⅳ期表達量顯著高于其他時期。Ⅱ期和Ⅳ期分別為內源性卵黃和外源性卵黃積累的重要時期[10], 因此, 推測PtUHRF1基因可能在三疣梭子蟹卵黃積累調控過程中發揮重要作用。PtUHRF1基因在精巢Ⅳ期的表達顯著高于Ⅲ和Ⅴ期, Ⅳ期為精子期, 暗示PtUHRF1基因可能參與調控三疣梭子蟹精子的成熟過程[9]。

3.3 PtUHRF1基因在胚胎發育不同時期表達分析

三疣梭子蟹胚胎發育不同時期RT-PCR結果發現,PtUHRF1表達量在不同發育時期差異顯著, 隨著胚胎的發育呈現先下降后上升的趨勢, 受精卵時期表達顯著高于其他時期(P＜0.05), 表明其可能在三疣梭子蟹胚胎發育調控中發揮重要作用。PtUHRF1與斑馬魚胚胎發育過程中該基因表達模式相似[6]。在斑馬魚中的研究發現,UHRF1通過調節DNA甲基化水平參與胚胎發育調控。敲除UHRF1基因, 會造成胚胎整體DNA甲基化水平顯著下降, 進而造成肝臟、眼等發育缺陷, 導致斑馬魚胚胎死亡。在本實驗中,PtUHRF1在V期卵巢中的表達要顯著高于受精卵, 提示受精卵中的PtUHRF1可能為母源表達。該基因在多細胞期和囊胚期的表達顯著低于受精卵期, 可能是由于母源mRNA的逐漸降解。以往的研究發現, 敲除成熟的卵細胞還是受精卵中的UHRF1, 胚胎發育到囊胚期或原腸胚時期基本死亡[8]。綜合以上結果表明,UHRF1基因在真核生物的胚胎發育中有重要的功能。

本實驗首次克隆獲得三疣梭子蟹PtUHRF1基因cDNA全長, 分析了PtUHRF1在三疣梭子蟹不同組織, 以及胚胎、幼體和性腺發育不同時期表達差異, 推測其參與了三疣梭子蟹胚胎、幼體和性腺生長發育的調控, 該結果為進一步了解UHRF1基因對三疣梭子蟹和其他甲殼動物生長發育中的作用提供參考。