PFOS對中華倒刺鲃幼魚爆發游泳及運動后代謝恢復的影響

夏繼剛 李秀明 付世建

(重慶師范大學生命科學學院進化生理與行為學實驗室, 重慶市動物生物學重點實驗室, 重慶 401331)

全氟辛烷磺酸(Perfluorooctane sulfonate, PFOS,C8F17SO3)是全氟化合物家族中具有代表性的一種持久性有機污染物(Persistent Organic Pollutants,POPs), 被稱為“工業味精”, 由于具有疏水、疏油、耐高溫等特性, PFOS被廣泛應用于紡織與印染、影像材料、半導體、電鍍鉻霧抑制劑、皮革與塑料加工、表面活性劑、泡沫滅火劑、防護涂料以及醫藥品等各類產品的生產中[1—5]。PFOS在環境中難以降解、易在生物體內蓄積、毒性較強[6, 7],這些特性導致PFOS在全世界范圍內的各類環境介質以及動植物體內被廣泛檢測出[1, 6, 8]。2009年5月,PFOS作為一種新型的POPs被增列入《斯德哥爾摩公約》。2018年1月, 我國將PFOS正式列入《中國嚴格限制的有毒化學品名錄》。

PFOS在我國水域生態系統的污染較為嚴重[1, 9—12]。例如, 長江上游、嘉陵江江水以及下游三峽庫區江水均存在著不同程度的PFOS污染[12],不僅如此, 在長江野生魚體內也普遍檢測出了PFOS[9]。PFOS對魚類等水生生物健康的影響以及水生生態系統安全的潛在威脅已成為當前人們高度關注的水環境問題。

PFOS具有環境內分泌干擾作用, 可以引發遺傳毒性、繁殖與發育毒性、免疫與神經毒性等[2, 8, 13, 14]。近期研究表明, PFOS還具有代謝毒性,能夠導致魚類代謝水平升高、有氧運動能力以及游泳效率下降[4, 15], 尚未見PFOS對魚類爆發游泳能力及其相關代謝特征的影響的研究報道。爆發游泳(Burst swimming)是一種快速的高能耗游泳運動,在魚類捕食獵物、逃避捕食者、穿越激流尋找適宜生境等生存活動中發揮重要作用[16, 17]。另一方面, 由于爆發游泳主要依賴于無氧代謝供能, 其持續的時間往往較短, 力竭運動后的代謝恢復能力將直接影響到魚類后續的爆發游泳性能[16, 17, 18], 因此對魚類的生存適合度至關重要。

為探究PFOS污染對魚類爆發游泳及其代謝恢復能力的影響, 本研究以長江中上游廣泛分布的中華倒刺鲃幼魚(Spinibarbus sinensis)為對象, 考察了不同濃度PFOS暴露對該物種靜止代謝率(Resting metabolic rate, RMR)、爆發游泳速度(Burst swimmingspeed,Uburst)以及運動力竭后代謝恢復特征的影響, 為評估PFOS的代謝毒性及其潛在的生態風險提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

中華倒刺鲃(Spinibarbus sinensis)幼魚購于重慶市當地魚市, 于實驗室條件下馴養適應2周。實驗用水為充分曝氣脫氯并經過活性炭過濾的自來水, 水溫(18.0±0.5)℃, 溶解氧＞8 mg/L, 光暗周期15 L∶9 D, 飼養密度ρ＜0.5 g/L, 氨氮濃度＜0.02 mg/L;每日投喂1次冰凍紅蟲, 投喂5min后, 吸去殘餌。在馴養結束后, 選取大小相近、健康活潑的中華倒刺鲃幼魚[(2.88±0.07) g, (5.68±0.04) cm,n=60]開展實驗。

PFOS(純度＞99%)購自Tokyo Kasei Kogyo Co.Ltd(Tokyo, Japan), 其余化學品購自Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)。將PFOS以二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)為助溶劑, 配置成0.5 g/mL的PFOS母液, 4℃避光保存, 待用。

1.2 實驗設計

采用半靜態暴露法, 暴露容器為方形玻璃缸(42 cm ×22 cm ×42 cm, 長×寬×高, 實際水量為22 L)。基于前期實驗研究[4, 5]并參考實際環境中可能出現的PFOS濃度(最高可達6.57 mg/L)[19], 本實驗共設5個PFOS濃度梯度組, 分別為對照組(0)、0.32、0.8、2和5 mg/L PFOS暴露組, 各組DMSO濃度不超過0.001% (v/v), 暴露時長為4周。每個濃度梯度處理隨機放入馴化適應后的中華倒刺鲃幼魚12尾(n=12)。暴露期間, 每天更換含有相應濃度PFOS的水溶液50%, 所更換的新水體均在換水前新配置, 新水體PFOS濃度與實驗設置濃度保持一致。除水體含有PFOS污染物外, 其余飼養狀況及水質條件與馴化期間相同。污染水體經活性炭過濾后排入污水處理系統。

在暴露結束后, 依次對實驗魚的靜止代謝率(RMR), 暴發游泳速度(Uburst)以及力竭運動后的代謝恢復特征(Excess post-exercise oxygen consumption, EPOC)等進行測定, 各測定參數的樣本量均為n=12。

1.3 參數測定

RMR采用流水式呼吸代謝測定儀測定RMR[20]。測定前將實驗魚禁食24h, 之后將單尾實驗魚移入呼吸室(100 mL)并使其適應24h。在適應結束后, 分別于3個時間段(10:00、14:00和18:00)使用溶氧儀(HQ30, Hach Company, Loveland, CO,USA; 測量精度為0.01 mg O2/L)檢測呼吸室內環境溶氧水平的變化(每個時間段測定3次), 最后將平均值用于計算。RMR以單位時間內實驗魚的呼吸耗氧量表示, 計算公式如下:

式中, ΔO2(mg/L)為實驗魚所在呼吸室和空白呼吸室(無魚室)出水口處溶氧水平的差值;v(L/h)為呼吸室的水流速度;m(kg)為實驗魚的體重。測試水溫為(18.0±0.5)℃。為了避免水體溶氧降低可能引發的生理應激, 在整個實驗過程中, 呼吸室內的溶氧水平不低于水體飽和溶氧的85%。

爆發游泳能力采用魚類游泳代謝儀測定Uburst。該設備體積3.5 L, 橫截面積19.9 cm2, 其結構與工作原理詳見Li等[21], 游泳管連接計算機, 管內的水流速度由編寫的程序控制。測定時, 將單尾實驗魚放入游泳管中適應1h以使其適應流水環境, 適應水流為6 cm/s(約為一倍體長/s), 測試水溫為(18.0±0.5)℃。在適應結束后, 將測定儀中的水流速度以0.167 cm/s2的加速度持續增加, 直至實驗魚到達運動力竭狀態, 實驗魚力竭時的水流速度即為其爆發游泳速度[16]。力竭狀態的評判標準為實驗魚無力前進游泳并停留在游泳管末端篩板20s以上。將Uburst除以實驗魚體長記為相對爆發游泳速度(relativeUburst,rUburst)。

運動力竭后代謝恢復特征將運動力竭后的實驗魚立即放入流水式呼吸代謝測定儀并監測呼吸室內溶氧量的變化[22], 數據采集時間分別為實驗魚放入呼吸室前(0)以及放入后的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28和30min。依據呼吸室內溶氧值的動態變化特征, 計算得出以下參數: (1)運動后代謝峰值, 即實驗魚在運動力竭后恢復過程中觀測到的最大代謝率(Maximum metabolic rate, MMR)[mg O2/(kg·h)]; (2)代謝率增量(MMR-RMR)[mg O2/(kg·h)], 即力竭運動前后代謝率的變化量也叫代謝范圍(Metabolic scope, MS); (3)代謝變化倍差(MMR/RMR), 即力竭運動前后代謝率變化的倍率(Factorial metabolic scope, F-MS); (4)力竭運動后過量氧耗(EPOC)(mg O2/kg), 即實驗魚在力竭運動后恢復過程中各個時間點高于RMR的差值在時間上的積分。

1.4 數據處理

應用軟件SPSS for Windows 16.0 (SPSS Inc.,USA)對數據進行統計分析。首先對實驗數據進行正態性和方差齊性檢驗, 然后采用單因素方差分析(ANOVA)和Tukey’s HSD法檢驗差異顯著性。各組數據均以平均值±標準誤表示, 顯著性水平設在P＜0.05。

2 結果

2.1 PFOS對RMR的影響

暴露濃度對實驗魚RMR的影響顯著(F=5.04,P=0.002), 高濃度處理導致RMR顯著升高 (表 1)。

2.2 PFOS對爆發游泳能力的影響

暴露濃度對實驗魚的Uburst和rUburst均影響顯著(Uburst,F=4.92,P=0.002;rUburst,F=3.59,P=0.011),高濃度處理導致Uburst和rUburst均顯著降低(圖 1); 然而, 在最低劑量PFOS暴露下Uburst和rUburst亦有下降的趨勢(圖 1), 0.8和0.32 mg/LPFOS暴露組相比,rUburst顯著升高(P=0.013), 5和0.8 mg/LPFOS暴露組相比,rUburst顯著下降(P=0.002)。

2.3 PFOS對運動力竭后代謝恢復特征的影響

不同濃度PFOS處理的實驗魚在運動力竭后的代謝恢復特征見圖 2, 所有處理組的代謝率都快速上升達到峰值, 隨后逐步下降并逐步恢復到運動前水平。PFOS對實驗魚的MMR、MS、F-MS、EPOC均無顯著影響(P＞0.05)(表 1)。

3 討論

3.1 PFOS對爆發游泳能力的影響

游泳能力作為表征魚類達爾文適合度的重要指標, 通常被用來預測魚類的生態表現及其棲息地的生態適宜性[23—26]。在本研究中, 高濃度(5 mg/L)PFOS暴露導致中華倒刺鲃幼魚的Uburst和rUburst分別下降了17.4%和10.8%, 提示PFOS污染將可能對魚類捕食——逃避捕食者、穿越激流尋找適宜生境等生存關聯的生命活動起到負面影響[16, 17]。前期研究表明, PFOS可對中華倒刺鲃幼魚的臨界游泳速度[4]以及快速啟動游泳能力[5]等均產生重要的負面效應, 結合本研究實驗結果可以看出, 該物種的多種游泳性能均對水體PFOS污染較為敏感, 可作為PFOS污染重要的生態指示。此外, 值得關注的是, 在最低劑量PFOS暴露下Uburst和rUburst亦有下降的趨勢(圖 1), 表現出潛在的“低劑量效應”;PFOS對rUburst的影響還表現出一定的“非單調劑量效應”, 即隨著PFOS濃度升高,rUburst表現出先降后升再降的趨勢。PFOS毒理學作用的非單調劑量效應已引起研究者的較大關注[27—30]。例如, 有研究發現, 己烯雌酚(Diethylstilboestrol)對小鼠前列腺發育的影響呈現低劑量增殖高劑量抑制的“倒U形”劑量-效應關系[27]; 斑馬魚(Danio rerio)仔魚的吻寬/體長隨著PFOS暴露濃度的升高, 呈現出先下降后升高的趨勢, 0.1 mg/L PFOS暴露導致斑馬魚仔魚吻寬/體長顯著下降, 而1 mg/L PFOS暴露與對照組相比無顯著性差異[2]。PFOS非單調劑量-效應的作用機制尚不清楚, Welshons等[31]用“游離受體假說”解釋這種毒理學作用效應, 認為這些具有環境內分泌干擾作用的污染物在較低濃度下與其相對應的游離受體發生反應, 但當其相應的受體達到飽和以后,便又有可能與其他受體發生反應或引發其他方面的生物學效應。

3.2 PFOS對RMR及運動后代謝恢復的影響

RMR為魚體在靜止并且空腹狀態下的代謝率,在一定程度上反映了機體運行基本生理功能的維持能量消耗和整體生理狀況, 在魚類生理生態學研究中受到廣泛關注。在本研究中, PFOS對中華倒刺鲃幼魚的RMR影響顯著, 高濃度(5 mg/L)PFOS暴露導致RMR顯著升高 了25.7%, 提示遭遇污染環境下的實驗魚需要花費更多的能量用于“解毒”、機體修復以及維持內穩態[25, 32]。RMR升高可能主要與PFOS暴露致使機體糖代謝功能紊亂有關。研究發現, PFOS暴露可以抑制許氏平鲉(Sebastes schlegeli)鰓組織Na+-K+ATP酶活性并降低血糖水平[33];1 mg/L PFOS暴露即可導致杜父魚(Cottus gobio)線粒體細胞色素c氧化酶(Cytochromecoxidase)活性降低40.2%、檸檬酸合成酶(Citrate synthase)活性顯著提升19.9%, 并影響鰓組織能量代謝相關的蛋白的表達[34]。值得關注的是, 盡管RMR受PFOS暴露的影響顯著, PFOS對實驗魚的MMR、MS、FMS、EPOC均無顯著影響。MMR的非顯著性變化提示水體PFOS污染主要是改變實驗魚能量代謝水平的

表 1 PFOS對中華倒刺鲃幼魚RMR和力竭運動后代謝恢復的影響Tab. 1 The effects of PFOS on RMR and metabolic recovery after exhaustive swimming in juvenile Spinibarbus sinensis

圖 1 PFOS對中華倒刺鲃幼魚爆發游泳能力的影響Fig. 1 The effects of PFOS on the Uburst (A) and rUburst (B) in juvenile Spinibarbus sinensis

圖 2 不同濃度PFOS處理下實驗魚在運動力竭后的代謝恢復特征Fig. 2 Metabolic recovery after exhaustive swimming in juvenile Spinibarbus sinensis upon exposure to different PFOS concentrations

下限, 而對其能量代謝水平的上限無明顯的限制性作用。MS和F-MS的非顯著性變化則表明PFOS對實驗魚的代謝空間無顯著影響, 研究結果與Xia等[4]一致。EPOC是動物運動后恢復期超過靜止狀態耗氧量水平的額外耗氧量, 體現了魚類的無氧代謝及其代謝恢復能力; 通常EPOC越大, 魚類的無氧代謝能力也越強[35]。力竭運動后EPOC的變化主要與魚體白肌中能量代謝底物恢復和代謝廢物的清楚速率等有關[21, 36], 在本研究中, 中華倒刺鲃幼魚的EPOC不受PFOS暴露的影響, 提示PFOS可能對其無氧代謝關聯的代謝恢復能力無顯著的生態毒理效應。