雙羧型1,8-萘酰亞胺探針與DNA的 鍵合行為及抗腫瘤作用

婁珀瑜, 劉 振, 孫 洋, 冉 鳴

( 1. 西安文理學(xué)院 服務(wù)地方研究院， 陜西 西安 710065； 2. 西安文理學(xué)院 化學(xué)工程學(xué)院， 陜西 西安 710065；3. 四川師范大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院， 四川 成都 610066)

在癌癥作為威脅人類生命健康的主要疾病之一的今天，探討高效低毒抗腫瘤藥物的機(jī)制具有非常重要的意義.該領(lǐng)域目前在以DNA作為靶點(diǎn)的抗腫瘤小分子藥物研究方面關(guān)注頗多[1-2].萘酰亞胺類化合物具有強(qiáng)烈熒光、良好熱穩(wěn)定性及較高量子效率等特征，可用來(lái)作為潛在的光敏生物單元以及抗腫瘤劑[3-4].自3-硝基單萘酰亞胺類衍生物被證明能有效嵌入DNA之后[5]，已研制出進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)的米托萘胺[6]和氨萘非特[7]等藥物，隨后研發(fā)出的雙萘酰亞胺能夠提高嵌入劑分子與DNA的親和力并形成穩(wěn)定的復(fù)合物[8]，在此基礎(chǔ)上研制出的依利萘法德[9]和雙萘法德[10]已處于臨床研究階段.

本研究設(shè)計(jì)合成了新型1,8-萘酰亞胺衍生物，通過(guò)紅外光譜、紫外可見(jiàn)吸收光譜、熒光光譜、圓二色譜和熱變性實(shí)驗(yàn)對(duì)合成化合物與小牛胸腺DNA(Ct-DNA)的鍵合行為進(jìn)行了研究，同時(shí)利用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢驗(yàn)了合成化合物對(duì)Bel-7402、HL-60、A549以及Hela等4種細(xì)胞的體外抗腫瘤活性.此工作為研究嵌入單元與鏈接基之間的特異性提供了實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)，同時(shí)也為其他化合物鏈接基的分子設(shè)計(jì)奠定一定的基礎(chǔ).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1主要試劑4-溴-1,8-萘酐、四氫糠醇、CTAB(溴化十六烷基三甲胺)、乙二胺、丙二胺、丁二胺、戊二胺、己二胺、甲醇、無(wú)水乙醇等均購(gòu)自上海阿拉丁試劑有限公司;小牛胸腺DNA(染發(fā)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)90%)購(gòu)自Sigma試劑公司；DNA的PBS標(biāo)準(zhǔn)溶液(ρ=10.0 mg/mL，pH值7.4)自制；實(shí)驗(yàn)用水為二次去離子水.

1.2主要儀器IS50傅里葉變換紅外光譜(美國(guó)熱電公司),Q2000差示掃描量熱儀(美國(guó)TA公司),AVANCF300MHz核磁共振儀(德國(guó)布魯克公司),F-7000熒光光譜儀(日本日立公司),UV-2550PC紫外光分光光度計(jì)(日本島津公司),Chirascan圓二色譜(英國(guó)應(yīng)用光物理公司),ANKETGL-16C離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠),PHS-3C型精密pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司).

圖 1 目標(biāo)產(chǎn)物合成路線

化學(xué)式摩爾質(zhì)量/(g·mol-1) m/zν(IR)/cm-1元素分析/%C23H24N2O8a456.15456.15(100%)457.16(25.5%)458.16(4.8%)3 354(NH)2 824(CH)1 756(CO)1 480(OH)C 60.52H 5.30N 6.14O 28.04C24H26N2O8b470.17470.17(100%)471.17(27.0%)472.18(3.4%)3 351(NH)2 834(CH)1 758(CO)1 470(OH)C 61.27H 5.57N 5.95O 28.04C25H28N2O8c484.18484.18(100%)485.19(27.7%)486.19(5.3%)3 344(NH)2 823(CH)1 746(CO)1 470(OH)C 61.97H 5.83N 5.78O 26.42C26H30N2O8d498.20498.20(100%)499.20(29.2%)500.21(4.0%)3 354(NH)2 814(CH)1 753(CO)1 489(OH)C 62.64H 6.07N 5.62O 25.67C27H32N2O8e512.22512.22(100%)513.22(29.9%)514.22(6.1%)3 352(NH)2 824(CH)1 736(CO)1 485(OH)C 63.27H 6.29N 5.47O 24.97

1.3萘酰亞胺探針的合成如圖1，按照文獻(xiàn)[11]報(bào)道的方法制備中間產(chǎn)物1，其結(jié)構(gòu)經(jīng)化學(xué)和光譜法(1H NMR，IR)表征后與文獻(xiàn)報(bào)道相一致.接著在圓底燒瓶中加入中間產(chǎn)物1(2 mmol)、四氫糠醇(5 mL)、CTAB(0.13 g)以及二甲基氨基乙醇(10 mL)，60 ℃下攪拌加熱6 h，以0.5 mol/L的乙醇溶液(溶劑氯仿)萃取得到不同鏈長(zhǎng)的黃色固體2(a～e).最后以二氯甲烷為溶劑，體積分?jǐn)?shù)為10%的乙酸乙酯為流動(dòng)相進(jìn)行柱層析，各個(gè)探針表征數(shù)據(jù)如表1.

2 結(jié)果與討論

2.1探針對(duì)Ct-DNA紅外光譜的影響在Ct-DNA中分別滴加a～e探針，在波長(zhǎng)為1 000～5 000 cm-1測(cè)其紅外光譜，如圖2所示.

1: DNA; 2: a+DNA; 3: b+DNA;

可以看出，Ct-DNA分別在1 100和1 800 cm-1處因ON振動(dòng)出現(xiàn)吸收峰，當(dāng)Ct-DNA加入熒光探針后，在1 100和1 800 cm-1處出現(xiàn)了明顯強(qiáng)吸收.此現(xiàn)象可以說(shuō)明，加入的探針被Ct-DNA包圍后，可能在Ct-DNA表面同Ct-DNA結(jié)合，也可能嵌插到Ct-DNA內(nèi)部.由于在1 100 cm-1處吸收強(qiáng)度變化十分明顯，故此處探針以嵌插的方式同Ct-DNA結(jié)合的可能性較大.此外，隨著探針鏈長(zhǎng)增加，吸收強(qiáng)度逐漸減小，說(shuō)明探針與Ct-DNA的鍵合作用隨探針鏈長(zhǎng)的增加而減弱，這與文獻(xiàn)[12]中的報(bào)道一致.

2.2探針對(duì)Ct-DNA紫外可見(jiàn)吸收光譜的影響在5個(gè)5 mL比色管中分別加入2 mL 0.5 mg/mL的Ct-DNA，再分別加入0、10、20、30和40 μL探針溶液，室溫放置15 min后，以Ct-DNA溶液為參比，掃描300～500 nm處的紫外吸收光譜如圖3所示.

V(DNA)=2 mL； A～D=10、20、100、200 μL

在探針a～e與Ct-DNA的鍵合紫外可見(jiàn)吸收光譜圖中，可以看到在450 nm處出現(xiàn)強(qiáng)吸收峰，這是由于n→π*躍遷而產(chǎn)生.探針a～e的吸收強(qiáng)度隨著探針體積的增大而增大，最大吸收峰表現(xiàn)出不太明顯的藍(lán)移，這是由探針與Ct-DNA鍵合后的疏水作用而引起的.圖3中隨著側(cè)鏈長(zhǎng)度的增長(zhǎng)，吸光度的變化不很明顯.

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的曲線擬合處理如下式

A=Kc+b,

(1)

其中,A為吸光度,c為探針濃度.

數(shù)據(jù)處理結(jié)果如表2所示,可以得知探針a～e與Ct-DNA的結(jié)合常數(shù)在0.539 1、0.528 4、0.498 7、0.534 5和0.522 4處.

表 2 通過(guò)紫外可見(jiàn)吸收光譜研究探針a～e與 Ct-DNA作用的鍵合常數(shù)K與光照性質(zhì)

根據(jù)圖3和表2，可以表明探針a～e與Ct-DNA的結(jié)合表現(xiàn)出相似的鍵合型.由此可以猜測(cè)，不同側(cè)鏈長(zhǎng)度的探針a～e對(duì)Ct-DNA的鍵合性能有很弱的影響.但是，通過(guò)對(duì)a～e探針的相對(duì)比較，探針a的吸收強(qiáng)度比其他探針稍微大一些.由此可以說(shuō)明，探針a與其他探針相比能夠更好地嵌入到Ct-DNA中.

2.3探針對(duì)Ct-DNA熒光發(fā)射光譜的影響在5個(gè)5 mL比色管中分別加入2 mL 0.5 mg/mL的Ct-DNA，再分別加入0、10、20、30和40 μL的探針溶液.室溫放置15 min后，以Ct-DNA溶液為參比，掃描350～650 nm熒光發(fā)射光譜，如圖4所示.

在探針Ct-DNA熒光譜圖中，420 nm周圍出現(xiàn)高頻，這表明隨著探針體積增加，親水作用明顯增強(qiáng)，在譜圖中明顯出現(xiàn)了約10 nm的紅移.在圖5的(a)、(b)圖中產(chǎn)生一組新發(fā)射峰，說(shuō)明探針a、b與Ct-DNA可能發(fā)生了嵌入作用，而其他探針可能發(fā)生的是表面結(jié)合作用.由于探針a比探針b的熒光發(fā)射強(qiáng)度大，使得探針a能更好嵌入Ct-DNA中.

探針與Ct-DNA結(jié)合激發(fā)態(tài)分子間碰撞所發(fā)生的相互作用過(guò)程可以用探針與Ct-DNA作用的動(dòng)態(tài)增強(qiáng)過(guò)程來(lái)反映，用Stern-Volmer方程[13]描述為

F0/F=1+KSVca,

(2)

其中,F0和F分別為探針與Ct-DNA作用前后的熒光強(qiáng)度，KSV為熒光增強(qiáng)常數(shù)，用來(lái)衡量探針的增強(qiáng)速率，ca表示探針的濃度.

對(duì)于探針與Ct-DNA作用的熱力學(xué)函數(shù)[14-17]，利用如下公式進(jìn)行計(jì)算：

ln(K2/K1)=(1/T1-1/T2)ΔH/R,

(3)

ΔG=-RTlnK=ΔH-TΔS,

(4)

其中，R為氣體常數(shù)，T為溫度，K為結(jié)合常數(shù).當(dāng)溫度變化不大時(shí)，焓變?chǔ)可以看做是一個(gè)常數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表3.

表3中呈現(xiàn)的不同溫度下的熱力學(xué)數(shù)據(jù)均有△H<0，表明探針與Ct-DNA的結(jié)合釋放熱量.通過(guò)文獻(xiàn)[18]總結(jié)出的生物大分子與小分子結(jié)合力類型的熱力學(xué)規(guī)律可知，對(duì)于疏水作用力而言，△H>0，△S>0；對(duì)于氫鍵或者范德華力而言，△H<0，△S<0；對(duì)于靜電作用力而言，△H<0.由于表3的數(shù)據(jù)均小于0，可知探針與Ct-DNA的結(jié)合是焓熵協(xié)同驅(qū)動(dòng)過(guò)程，且以氫鍵與靜電作用力結(jié)合為主.Takenaka等[19]報(bào)道藥物與Ct-DNA發(fā)生嵌插結(jié)合的顯著特征是氫鍵作用，也更進(jìn)一步證明探針與DNA的結(jié)合方式是嵌插.

表 3 探針與Ct-DNA不同溫度下作用的結(jié)合常數(shù)及熱力學(xué)參數(shù)

由此推斷，探針與Ct-DNA相互作用過(guò)程是放熱的焓熵協(xié)同驅(qū)動(dòng)過(guò)程.當(dāng)探針Ct-DNA相互作用時(shí)，探針的雙羧基插入DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)的堿基對(duì)之間，以氫鍵和靜電作用進(jìn)行相互作用.

2.4探針對(duì)Ct-DNA圓二色光譜的影響在5個(gè)5 mL比色管中分別加入2 mL 0.5 mg/mL的Ct-DNA，再分別加入0、10、20、100和200 μL的探針溶液.室溫放置15 min后，以Ct-DNA溶液為參比，掃描200～300 nm熒光發(fā)射光譜，如圖5所示.

μmol/L

分析結(jié)果可見(jiàn)，正峰表示Ct-DNA的堿基堆積程度，負(fù)峰表示Ct-DNA的螺旋松散程度[20].Ct-DNA的圓二色譜在276 nm處有一正峰，在243 nm處有一負(fù)峰，a～e加入均可引起圓二色譜正峰增強(qiáng)、負(fù)峰減弱，表明該類化合物可以嵌入Ct-DNA分子[21].經(jīng)對(duì)比分析可知，隨著合成物連接基長(zhǎng)度的增加，探針正峰和負(fù)峰強(qiáng)度增加和減弱程度呈下降趨勢(shì)，即e

2.5探針與Ct-DNA作用的熱分析在25～120 ℃范圍內(nèi)，以3 ℃/min的升溫速率，對(duì)所得探針與Ct-DNA進(jìn)行了熱重-差熱分析，如圖6所示.純Ct-DNA在36 ℃左右開始放熱，在45 ℃左右放熱基本結(jié)束.當(dāng)將探針加入Ct-DNA中后，從40 ℃左右開始放熱，a～e探針?lè)謩e在78、70、69和68 ℃放熱基本結(jié)束.探針a與Ct-DNA放熱最多，說(shuō)明探針a與Ct-DNA的結(jié)合更緊密，為嵌插作用.其他探針與Ct-DNA可能進(jìn)行表面結(jié)合作用或溝槽結(jié)合作用.此現(xiàn)象表明，探針與Ct-DNA作用隨著鏈長(zhǎng)的增加而減弱，其中探針a與Ct-DNA的作用最緊密，這與前面各圖譜的結(jié)果相符合.

圖 6 探針與Ct-DNA作用的DSC曲線

2.6抗腫瘤作用研究利用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)染色法分別測(cè)定了探針a～e對(duì)A549、Hela、Bel-7402和HL-60細(xì)胞體外抗腫瘤活性.在以順鉑為陽(yáng)性對(duì)照時(shí)，由表4的數(shù)據(jù)可以看出，對(duì)A549和Hela細(xì)胞株，增長(zhǎng)探針側(cè)鏈，細(xì)胞毒性變化很大，但隨側(cè)鏈增長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)；對(duì)于Bel-7402和HL-60細(xì)胞株，探針側(cè)鏈的增長(zhǎng)造成的細(xì)胞毒性變化很小，探針活性同時(shí)呈下降趨勢(shì),其中，乙二胺修飾的A549細(xì)胞株的探針a為3.23 μmol/L，優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照順鉑.因此探針與Ct-DNA分子的鍵合行為發(fā)現(xiàn)探針a對(duì)Ct-DNA有較好的抗腫瘤活性.

2.7探針嵌入DNA過(guò)程模擬圖由于小分子對(duì)核酸主要有非共價(jià)鍵結(jié)合、共價(jià)鍵結(jié)合和剪切作用3種方式，因此通過(guò)對(duì)圖6中各光譜曲線的分析，探針對(duì)Ct-DNA的作用可能存在的結(jié)合方式如圖7所示.

圖 7 探針與Ct-DNA可能的結(jié)合方式

圖7顯示表面結(jié)合的探針作用于Ct-DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的外壁，無(wú)選擇性；溝槽結(jié)合是探針與Ct-DNA的大溝或小溝的堿基對(duì)邊緣直接作用；嵌插結(jié)合是探針中的平面成分嵌入Ct-DNA的堿基之間.

3 結(jié)論

通過(guò)縮合取代反應(yīng)合成新型雙羧基型1,8-萘酰亞胺類化合物，并研究了其與Ct-DNA的結(jié)合作用及結(jié)合模式.光譜研究結(jié)果表明探針以嵌插方式與Ct-DNA結(jié)合，并且隨著烷基鏈增加，誘發(fā)疏水作用增強(qiáng)從而導(dǎo)致嵌插入Ct-DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)和堿基堆積力等結(jié)合作用減弱.熱力學(xué)研究結(jié)果表明，隨著探針烷基鏈的增加，放熱逐漸減少，結(jié)合作用減弱，烷基鏈最短的探針a同時(shí)具有較強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞毒性作用.以上實(shí)驗(yàn)結(jié)論說(shuō)明探針a與Ct-DNA的嵌插結(jié)合更緊密，其他探針與Ct-DNA可能進(jìn)行表面或溝槽結(jié)合作用.

綜上所述，雙羧基型1,8-萘酰亞胺類化合物的合成為新型腫瘤抑制劑的開發(fā)以及抗腫瘤活性機(jī)制研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ).