一例耐藥大腸桿菌仔豬腹瀉病診斷及中藥治療報(bào)告

姜玲玲 楊麗娟 唐遠(yuǎn)江 盧昱希 徐景峨 余波 張楊子

（貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 550005）

仔豬腹瀉是嚴(yán)重威脅仔豬生長(zhǎng)的疫病之一，我國(guó)仔豬腹瀉全年平均率為46.5%，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。仔豬腹瀉是一種多因素性疾病[1]，引起腹瀉的細(xì)菌性病原有大腸桿菌、沙門氏菌、魏氏梭菌、豬痢疾密螺旋體等；病毒性病原以豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒和豬輪狀病毒感染為主[2]；某些寄生蟲(chóng)性病原也會(huì)引起仔豬腹瀉[3]。其中產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC） 是引起人和幼畜（出生仔豬、羔羊、斷奶仔豬） 腹瀉的主要病原[4-5]。2001 年貴州省仔豬腹瀉發(fā)病率為54.8%[6]，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。黏附素是其重要的致病因子，黏附素能與動(dòng)物的小腸黏膜上皮細(xì)胞上的受體結(jié)合是ETEC 定居、繁殖，繼而產(chǎn)生腸毒素致病的首要條件。因大腸桿菌菌株血清型多，疫苗防治效果不好，臨床上常用抗生素控制該病[7]，但抗生素只能抗菌，不能控制腸毒素，細(xì)菌被抗生素殺死后會(huì)造成內(nèi)毒素在腸道內(nèi)釋放，導(dǎo)致內(nèi)毒素性休克、全身性炎癥反應(yīng)綜合征及多器官功能障礙等一系列問(wèn)題，另一方面，隨著養(yǎng)殖場(chǎng)不合理用藥，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥嚴(yán)重[8]，抗生素殘留引起的食品安全問(wèn)題給社會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重影響。中草藥有無(wú)殘留、不易產(chǎn)生耐藥性，利用我國(guó)特有的中醫(yī)理論和豐富的中藥資源研發(fā)控制仔豬腹瀉已被國(guó)內(nèi)外專家所重視。

本報(bào)告通過(guò)流行病學(xué)調(diào)查，病理解剖和實(shí)驗(yàn)室診斷最終確診為大腸桿菌性病原，采用石苦秦止痢散治療后痊愈。現(xiàn)將石苦秦止痢散治療仔豬大腸桿菌性腹瀉報(bào)告如下。

1 材料與診斷方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

貴州大方縣某養(yǎng)殖戶，發(fā)病18 頭，死亡3 頭，送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)4 頭。

1.1.2 試驗(yàn)試劑

氯化鈉 （成都金山化學(xué)試劑有限公司），胰蛋白胨（Oxoid），酵母提取物（Oxoid），瓊脂粉（Solarbio），營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（杭州微生物試劑有限公司），麥康凱營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司），2×TaqMaster Mix 和Goldview（天根生化科技有限公司），DL1000 Marker （Takara），瓊脂糖（Spain），TRIzol 試劑、SuperScriptIII 反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒為Invitrogen 公司產(chǎn)品。石苦秦散由貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所、成都乾坤動(dòng)物藥業(yè)有限公司提供；石苦秦散包裝規(guī)格：100g/袋；由石榴皮、苦參、秦皮經(jīng)水提后噴霧干燥制得；批號(hào)：20180520。主治：仔豬黃白痢。

1.1.3 試驗(yàn)儀器

超純水系統(tǒng)，ATZ-10-T，艾科浦U 系列純化水機(jī)，臺(tái)灣；PCR 擴(kuò)增儀，Biometra T-Gradient Thermoblock，德國(guó)；低溫離心機(jī)，Thermo Fisher Scientific Sorvall Legend Micro 21，美國(guó)；微量移液器，Eppendorf，德國(guó)；低溫冰箱，-20℃，美的，中國(guó)；水平電泳槽，DYY-III，北京六一儀器廠，中國(guó)；立式壓力蒸汽滅菌器，Boxun，中國(guó)；潔凈工作臺(tái)，SW-CJ-1F，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，中國(guó)；恒溫振蕩器，THZ-98A，上海一恒科學(xué)儀器有限公司，中國(guó)；核酸提取儀，Lab-Aid820，廈門百維信生物科技有限公司，中國(guó)。

1.2 診斷方法

1.2.1 臨床癥狀

養(yǎng)殖場(chǎng)5 月起斷斷續(xù)續(xù)出現(xiàn)仔豬腹瀉情況，發(fā)病仔豬多為5～10 日齡，出生后未出過(guò)圈舍。腹瀉仔豬精神沉郁或萎靡，反應(yīng)遲鈍，發(fā)抖，被毛粗亂無(wú)光澤，地板被糞便嚴(yán)重污染，拉黃色或灰白色稀糞，糞便中有胃消化乳糜顆粒，肛部污染嚴(yán)重，不愿采食。個(gè)別腹瀉嚴(yán)重的3～5d 后死亡。

1.2.2 病理解剖

對(duì)病死仔豬進(jìn)行解剖學(xué)觀察，仔豬消瘦，尸體蒼白，腸道有黃白色內(nèi)容物呈油膏狀，胃腸鼓氣，腸管擴(kuò)張，腸壁變薄，腸黏膜淋巴結(jié)腫大，個(gè)別仔豬心包積液，肝、腎腫大。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)室診斷

1.2.3.1 病毒性病原的檢測(cè)

采用3 重PCR 方法檢測(cè)常見(jiàn)的腹瀉病毒，分別是豬流行性腹瀉（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬輪狀病毒（PoRV） 的。具體操作如下：取高壓滅菌的棉拭子采取送檢的4 頭腹瀉仔豬肛門內(nèi)直腸糞便，加入0.1M 的PBS 稀釋，反復(fù)凍融兩次后于12000g 離心15min，按照TRIzol 說(shuō)明書(shū)提取總RNA，然后按照SuperScriptIII 反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA 為檢測(cè)模板，采用貴州大學(xué)PEDV、TGEV、PoRV3 重PCR 方法[9]進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果見(jiàn)附表。

附表 腹瀉病毒引物序列

PCR 反應(yīng)體系：2×TaqMaster Mix 12.5μL，PEDV、TGEV、PoRV 上下游引物各1μL，cDNA 模板2μL，用dd H2O 補(bǔ)至25μL。PCR 反應(yīng)條件為95℃3min，94℃30s，51℃30s，72℃45s，35 個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。取擴(kuò)增產(chǎn)物8μL 經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3.2 細(xì)菌分離與鑒定

（1） 細(xì)菌的培養(yǎng)

用無(wú)菌棉拭子取送檢的4 頭腹瀉仔豬肛門內(nèi)糞內(nèi)容物，將上述病料在麥康凱培養(yǎng)基上劃線后置于37℃恒溫箱培養(yǎng)24h后，挑取紅色不透明單個(gè)菌落，于普通瓊脂平板上劃線進(jìn)行純培養(yǎng)24h 后，將平板放置于4℃中保存。

（2） 細(xì)菌的革蘭氏染色鑒定

根據(jù)文獻(xiàn)選擇合適的革蘭氏染色方法[10]，按革蘭氏染色常規(guī)步驟進(jìn)行染色、鏡檢。

1.2.3.3 細(xì)菌的PCR 鑒定

（1） 核酸提取儀提取菌液DNA

具體操作如下：取腹瀉仔豬糞便內(nèi)容物1g，加入5ml 滅菌生理鹽水，充分混勻后于4000r/min 離心15min，棄沉淀，將上清轉(zhuǎn)移到新EP 管，于12000r/min 離心5min，收集沉淀，吸棄上清，加入30μLDTT 溶液 （1mol/L），將溶液轉(zhuǎn)移至Lab-Aid820 核酸提取儀進(jìn)行自動(dòng)提取。

（2） PCR 鑒定

引物序列參照文獻(xiàn)[11]，上游5'-GCAATAAGGTTGAGGTGAT'-3，下游5'-GCCTGCAGTGAGAAATGGAC-3'。PCR 反應(yīng)體系：2×TaqMaster Mix 12.5μL，上下游引物各1μL，2μL 模板，用dd H2O 補(bǔ)至25μL。PCR 反應(yīng)條件為95℃5min，94℃30s，54℃45s，72℃1min，30 個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。目的片段為368 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 PEDV、TGEV、PoRV3 重PCR 和大腸桿菌PCR 電泳檢測(cè)

采用3 重PCR 方法檢測(cè)豬流行性腹瀉（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬輪狀病毒（PoRV） 3種常見(jiàn)的腹瀉病毒，如圖1 的1～4 號(hào)，結(jié)果3種病毒均為陰性，說(shuō)明該養(yǎng)殖場(chǎng)仔豬腹瀉不是病毒性感染；圖1 的5～8 為產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌PCR 檢測(cè)，結(jié)果可見(jiàn)4 只豬均檢測(cè)出明顯的條帶，與目的條帶368bp 相符，表明該豬場(chǎng)腹瀉由產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌引起。

2.2 大腸桿菌革蘭氏染色圖片

實(shí)驗(yàn)室通過(guò)PCR 分子生物學(xué)檢測(cè)樣品可能為大腸桿菌感染，為進(jìn)行確診，對(duì)細(xì)菌分離純化培養(yǎng)后進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，結(jié)果如圖2，可見(jiàn)檢測(cè)細(xì)菌為革蘭氏陰性桿菌，染色后為紅色，形態(tài)呈單個(gè)存在、短小的桿狀。與大腸桿菌形態(tài)相符[12]。

圖1 樣品PCR 檢測(cè)結(jié)果

圖2 大腸桿菌革蘭氏染色鏡檢（10×10 倍）

3 治療與討論

本報(bào)告通過(guò)流行病學(xué)調(diào)查，排除寄生蟲(chóng)性病原感染，通過(guò)多重PCR 方法檢測(cè)病毒性病原均為陰性，通過(guò)病理解剖和實(shí)驗(yàn)室診斷最終確診為大腸桿菌性病原根據(jù)實(shí)驗(yàn)室診斷，確診為大腸桿菌引起的腹瀉，結(jié)合畜主訴說(shuō)抗生素治療效果不佳的現(xiàn)狀，項(xiàng)目組最終采用石苦秦止痢散進(jìn)行治療。治療方法：仔豬0.5g/kg，每天兩次，石苦秦散中藥用為溫開(kāi)水溶解后，直接人工灌胃，治療第3 天時(shí)，1 頭仔豬已基本不腹瀉，其余3 頭腹瀉明顯減輕，第5 天，4 只仔豬均不腹瀉，治愈良好。

大腸桿菌可引起不同日齡段仔豬腹瀉，根據(jù)仔豬排黑白色糞便可初步判定是大腸桿菌引起，PCR 檢測(cè)結(jié)果再次確診該養(yǎng)豬場(chǎng)感染產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌。袁萬(wàn)哲等[13]研究表明，產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（ETEC） 是引起仔豬腹瀉的主要病原，文獻(xiàn)表明貴州分離的333 株大腸桿菌，其中豬源產(chǎn)腸毒素大腸桿菌占77%[14]。賀丹丹[15]等對(duì)不同動(dòng)物源大腸桿菌的耐藥性進(jìn)行調(diào)查表明，健康豬對(duì)2 種或多種抗菌藥物有耐藥性，多重耐藥性的增加必然會(huì)導(dǎo)致聯(lián)合用藥的效果降低，從而影響臨床治療效果，增加治療成本。本診斷結(jié)果表明，當(dāng)前抗生素治療仔豬腹瀉已達(dá)不到明顯效果，本治療方案最終使用的石苦秦止痢散治愈4 頭仔豬，表明該復(fù)方制劑能有效治療仔豬腹瀉，而且對(duì)耐藥性大腸桿菌引起的腹瀉有良好效果，這為中草藥防治仔豬腹瀉提供理論依據(jù)。

仔豬腹瀉是多種因素導(dǎo)致，增加了診斷和防治難度，本次實(shí)驗(yàn)室采用多重PCR、普通PCR 結(jié)合傳統(tǒng)細(xì)菌分離鑒定技術(shù)對(duì)大腸桿菌性腹瀉進(jìn)行確診，發(fā)現(xiàn)豬場(chǎng)耐藥細(xì)菌存在普遍，為了減少耐藥性細(xì)菌的產(chǎn)生，用藥過(guò)程中要嚴(yán)格掌握，盡量避免長(zhǎng)期使用同一種藥物，不濫用抗生素，適當(dāng)條件下選擇中草藥治療可以達(dá)到更好的治療目的。