雷公藤新堿對LPS誘導小鼠骨髓樹突狀細胞成熟分化過程及炎癥因子分泌的影響

張 偉 閆越穎 王政潔

(菏澤市立醫院皮膚科，菏澤274000)

自1936年首次發現雷公藤紅素以來，人們在衛矛科雷公藤屬植物雷公藤中已分離得到生物堿、萜類及多糖等有效成份100余種[1,2]。既往研究表明雷公藤具有抗炎及免疫抑制作用，在類風濕關節炎、器官移植、腫瘤等疾病治療中具有顯著療效[3，4]。近期研究發現，雷公藤能夠阻止淋巴細胞增殖，誘導活化的淋巴細胞凋亡，對T細胞具有顯著的抑制作用[5，6]，但詳細機制不明；樹突狀細胞(Dendritic cells，DCs)是調控免疫系統最強細胞之一，其成熟后在T細胞激活過程中發揮關鍵作用，是機體激活T細胞的最重要因素[7]。

雷公藤生物學成份復雜，其生理活性成份主要為二萜內酯、生物堿、三萜等。其中生物堿包括雷公藤精堿(Wilforgine)、雷公藤新堿(Euonine)、衛矛堿(Euonymine)等[8]。雷公藤新堿分子式為C38H47NO18，作為雷公藤重要的活性成分之一，是否具有與雷公藤相似的藥理學作用及其詳細作用機制，有待進一步探討。本研究通過流式細胞術與抗體芯片技術檢測雷公藤新堿對LPS誘導樹突狀細胞(Dendritic cells，DCs)成熟過程中表面分子變化、抗原吞噬能力及細胞因子分泌的變化，以探明雷公藤新堿對DCs成熟過程影響的具體作用機制，為臨床應用雷公藤治療自身免疫性等炎癥相關疾病找到理論依據。

1 材料與方法

1.1材料 流式細胞儀購自BD公司(Aria2，BD,USA)，雌性C57BL/6小鼠購自山東大學動物實驗中心，RPMI1640培養基購自Gibco公司，無鈣鎂的Hank′s平衡鹽溶液購自Hyclone公司，rmGM-CSF購自瑞典ProSpec公司(#cyt-720)，rmIL-4購自美國R&D公司(# 404-ML-010)，LPS購自Sigma公司(#L2630)，MHCⅡ、CD80、CD86等流式抗體購自BD公司，抗體芯片購自Abcam公司(#Ab133995)，雷公藤新堿購自南京景竹生物科技有限公司(# 37239-48-8)。

1.2方法

1.2.1小鼠骨髓DCs的獲取 將C57BL/6小鼠頸椎脫位法處死，取出股骨與脛骨浸泡在RPMI1640培養中，用1 ml培養基沖洗骨髓腔中的骨髓，收集骨髓懸液，離心棄上清；加入細胞沉淀體積3倍量Tris-NH4Cl溶液室溫裂解紅細胞，離心棄上清，PBS洗滌2～3次；使用RPMI1640培養基重懸細胞，以細胞密度2×106ml-1接種于75 cm2培養瓶中，依次加入 rmIL-4 、mGM-CSF(工作液濃度為10 ng/ml)，37℃、 5%CO2培養48 h，每隔一天半量換新鮮培養基，培養5 d，流式細胞儀檢測樹突狀細胞純度。

1.2.2DCs成熟過程中MHCⅡ、CD80、CD86分子標志檢測 獲取小鼠骨髓DCs后，以6×105ml-1細胞濃度分別接種于無菌的A、B培養板中；A培養板加入終濃度1 μg/ml LPS，37℃、5%CO2培養48 h；B培養板加入終濃度1 μg/ml LPS與雷公藤新堿(工作濃度為40 ng/ml)混合液，37℃、5%CO2培養48 h；常規消化細胞后，向流式管中加入50 μl細胞懸液與1 μl抗小鼠MHCⅡ、CD80、CD86標志的熒光抗體，另取一支流式管加入50 μl細胞懸液作為空白對照；輕柔混勻后室溫避光靜置45 min，PBS洗滌2次；流式細胞術檢測DCs表面相關分子表達量變化。

1.2.3DCs抗原吞噬能力檢測 取上述A、B兩板中約一半細胞加入濃度為1 mg/ml的FITC-dextran，繼續培養1 h后收集細胞，調整細胞濃度至1×105ml-1，800 r/min離心5 min，棄上清后PBS洗2遍，流式細胞儀檢測DCs吞噬能力變化，同時以未處理細胞作為陰性對照。

1.2.4抗體芯片檢測 收集A、B兩板DCs細胞培養上清液；取出抗體膜置于反應盒中，向反應盒中緩慢加入2 ml 1×封閉液，室溫孵育30 min；棄去封閉液，輕輕加入1 ml 樣品液，室溫孵育1～2 h；去除樣品液，依次用2 ml 1×洗液Ⅰ、2 ml 1×洗液Ⅱ，各洗膜3次×5 min；用2 ml 1×封閉液溶解抗體管中的生物素，配成一抗反應液備用；向反應盒中加入1 ml上述一抗反應液，室溫孵育1～2 h；洗掉多余抗體；用1×封閉液稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗鏈酶生物素抗體，向反應盒中加入上述稀釋液2 ml，室溫孵育2 h；洗膜；各取ECL試劑盒中A、B液250 μl，混合均勻備用；將反應盒中的膜取出，置于保鮮膜上，加入染色液并采集數據。

1.3統計學方法 本實驗使用Graphpad Prism7.0軟件進行統計學分析(GraphPad Software，San Diego，CA，USA)。數據采用t檢驗，當P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1雷公藤新堿影響LPS誘導DCs成熟過程 加入雷公藤新堿組中DCs表面的協同刺激分子MHCⅡ、CD80、CD86的表達量與對照組相比明顯降低。結果如圖1所示，MHCⅡ分子實驗組55.3%，對照組66.7%；CD80實驗組36.4%，對照組62.4%；CD86實驗組36.5%，對照組60.2%，每組分別進行3次獨立實驗。以上結果表明雷公藤新堿可降低LPS誘導DCs成熟過程。

2.2雷公藤新堿增強 DCs抗原吞噬能力 實驗結果如圖2所示，與對照組相比，雷公藤新堿組吞噬FITC-Dextran的DCs比值增多，結果有統計學意義(P<0.01)。

圖1 雷公藤新堿降低LPS誘導DCs表面MHCⅡ、CD80、CD86表達量

圖2 雷公藤新堿增強DCs吞噬能力

表1雷公藤新堿作用后細胞因子分泌變化

Tab.1Changesofcytokinesecretionaftereuonineadministration

CytokinesFull nameLPS groupLPS+euonine groupP valueIL-13Interleukin 1345.55±3.6038.80±2.990.05IL-15Interleukin 15141.20±12.63115.17±8.900.05IL-1αInterleukin 1 Alpha114.74±7.2072.73±10.230.01IL-1βInterleukin 1 Beta 35.97±3.8016.88±4.550.001IL-2Interleukin 2 115.44±8.73105.02±9.560.08IL-3Interleukin 333.17±4.3235.88±5.100.12IL-4Interleukin 4 27.34±4.3334.72±2.740.08IL-6Interleukin 6 105.13±11.30110.41±14.570.11IL-7Interleukin 7 18.68±2.3011.97±4.390.05IL-8Interleukin 8 135.65±5.00221.63±14.300.01APC-1Antigen Presenting Cells 1990.22±72.89547.50±29.500.01APC-2Antigen Presenting Cells 265.80±10.7424.07±6.980.001M-CSFMacrophage Colony Stimulating Factor160.00±18.00136.50±22.800.01MIP-1αMacrophage Inflammatory Protein 1 Alpha103.80±17.3046.23±5.600.001MIP-1βMacrophage Inflammatory Protein 1 Beta1 054.38±58.601 014.83±78.110.26MIP-1δMacrophage Inflammatory Protein 1 Delta268.17±44.30361.87±26.890.05TGF-β1Transforming Growth Factor Beta 187.83±21.30110.85±37.200.05

圖3 小鼠抗體芯片檢測結果

2.3雷公藤新堿降低LPS誘導DCs上清中細胞因子分泌水平 檢測結果如表1和圖3所示，與對照組相比，雷公藤新堿實驗組可降低大部分細胞因子分泌水平，特別是APC-2、MIP-1α及IL-1β的表達水平較對照組明顯降低。實驗重復3次，結果顯示差異有統計學意義。

3 討論

DCs主要有DC1、DC2兩種亞型，其中DC1主要由細菌LPS、病毒等誘導產生，DC2則主要由IL-1、腫瘤壞死因子(TNF-α)誘導產生[9]。DCs的起源、表型以及亞型的異質性與多樣性決定了它復雜的生物學特性，體內多以不成熟DCs存在，不成熟的DCs具有較強的胞飲、吞噬及受體介導攝取抗原的能力，但幾乎沒有抗原遞呈的能力，且不能激活T淋巴細胞和免疫應答，其表面低表達共刺激分子、限制性標志分子與MHC分子等。當不成熟DCs由中樞淋巴器官、初級淋巴器官向外周、次級淋巴結遷移時，伴隨著DCs形狀、細胞表面分子數目及細胞因子受體形態的改變，逐漸演變為成熟的DCs。成熟的DCs高表達上述分子，同時上調趨化受體，大量分泌IL-1α、IL-1β、IL-8、IL-12等細胞因子[10]。成熟的DCs具有極強的抗原呈遞能力、可刺激淋巴T細胞活化增殖，啟動免疫應答，參與T細胞介導的特異性免疫應答[11]。DCs是唯一能激活初始T細胞(naive T cell,Tn)的抗原呈遞細胞，Tn活化以后分化成Th1、Th2、Th7以及調節性T細胞，Th1/Th2動態平衡是維持正常免疫狀態的關鍵，Th1/Th2比例失衡將會誘導炎癥性疾病的發生，因此DCs可通過該途徑參與多種疾病的發生發展進程[12]。

本研究發現小鼠骨髓DCs在加入雷公藤新堿后與單獨LPS誘導組相比，其表面分子MHCⅡ、CD80、CD86均明顯降低。LPS作為抗原成份刺激DCs成熟，使其共刺激分子、表面分子表達上調，從而有效激活T細胞誘導免疫應答[13]。以上結果表明雷公藤新堿能夠抑制DCs成熟，隨后我們又對DCs進行了抗原吞噬能力檢測，同樣發現雷公藤新堿干預后，DCs吞噬能力比未干預組顯著增強，該結果進一步表明雷公藤新堿可抑制LPS誘導DCs成熟作用，提示雷公藤可能通過抑制DCs成熟進而抑制T細胞參與機體免疫應答過程。

同時，本實驗利用抗體芯片技術發現雷公藤新堿干預組與對照組相比，IL-4、IL-8、MIP-1δ等細胞因子表現為細微上調現象，其他因子相對于對照組表達水平均有所下降。DCs細胞成熟一般需要共刺激分子的表達及細胞因子表達的上調[14]，LPS則主要通過與TLR4受體結合促進細胞分泌細胞因子。本研究中雷公藤新堿調控大部分TLR4通路細胞因子表達下調，表明雷公藤新堿可能通過TLR4信號通路調控DCs成熟過程，但詳細機制需進一步進行研究。與對照組相比APC-2、MIP-1α及IL-1β減少量尤為明顯，APC-2、MIP-1α及IL-1β等細胞因子主要激活CD4+Th1細胞亞群，導致炎癥的產生；而IL-4、IL-8、MIP-1δ等細胞因子主要激活CD4+Th2細胞亞群從而抑制炎癥。因此，我們的結果進一步表明雷公藤新堿影響DCs的成熟過程，也提示雷公藤新堿具有有效地抗炎作用。

DCs具有極強的抗原提呈能力，在免疫應答及免疫耐受中具有重要的作用。相信隨著研究的不斷深入，DCs終將成為治療皮膚病等各種炎癥性疾病、自身免疫病等疾病的重要作用靶點。雷公藤是臨床應用中非常重要的免疫抑制藥物，對免疫調節具有明顯的抑制作用及抗炎作用，已在臨床應用取得了可喜的成果。但雷公藤成分復雜，免疫調控機制尚不明確以及毒副作用較強，在如何取得單一有效的成分、降低毒副作用的發生等領域仍存在許多值得深入探討的問題。本研究發現雷公藤新堿作為雷公藤的重要組成分之一，可以有效抑制DCs的成熟過程，提示可能在DCs及T細胞參與的免疫性疾病中發揮關鍵作用，因此，本研究具有十分重要的理論與實踐意義。