骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)大鼠膀胱癌的治療效果

溫英武 李 強(qiáng)

(開(kāi)灤總醫(yī)院泌尿外科，唐山063000)

膀胱癌是我國(guó)泌尿系統(tǒng)疾病中最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近年來(lái)在全世界范圍內(nèi)發(fā)病率持續(xù)升高[1,2]。目前對(duì)于膀胱癌的病因以及發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，但其致病因素可以涉及遺傳、基因異常、環(huán)境、化學(xué)物質(zhì)暴露、慢性刺激等因素，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)健康[3]。膀胱癌的發(fā)病率與年齡呈正相關(guān)，隨年齡的增長(zhǎng)，發(fā)病率也會(huì)有所增加，并且男性的發(fā)病率要遠(yuǎn)高于女性[4,5]。在基因角度上分析，包括 c-myc、Survivin、Ras 等癌基因受到激活，p53、Rb、p16、p21 等抑癌基因發(fā)生了失活，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白如 cyclins、ATM 等的表達(dá)或功能異常均與膀胱癌的發(fā)生有直接關(guān)系[6,7]。目前臨床上手術(shù)治療是膀胱癌的主要治療手段，在手術(shù)治療的同時(shí)結(jié)合放化療以及生物治療同時(shí)進(jìn)行，但是手術(shù)治療的復(fù)發(fā)率很髙，總體的生存率不是十分理想。因此，尋求一種新的治療手段是切實(shí)需要解決的關(guān)鍵性課題，對(duì)膀胱癌的治療具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。

在對(duì)果蠅進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)研究中，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)了一條存在于細(xì)胞間起相互作用的信號(hào)通路：Notch信號(hào)途徑。Notch信號(hào)通路主要有3部分組成：Notch受體、Notch配體和CSL DNA結(jié)合蛋白。Notch受體基有4種，分別是：Notch1～Notch4；以及5種配體基因，包括：Jagged1、Jagged2、DELL1、DELL3以及DELL4。有學(xué)術(shù)研究已經(jīng)證實(shí)，Notch信號(hào)通路的相關(guān)因子在腫瘤的形成以及發(fā)展過(guò)程當(dāng)中起重要作用，而Notch1和Jagged1作為Notch信號(hào)通路的代表性因子，在腫瘤的形成以及腫瘤的轉(zhuǎn)移之中都發(fā)揮了不可替代的作用，所以本實(shí)驗(yàn)選取Notch1和Jagged1作為檢測(cè)腫瘤相關(guān)指標(biāo)的因子。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BMSCs的供體動(dòng)物：SPF級(jí)幼年雄性SD大鼠6只，3～5周齡，體重90～110 g。BMSCs的受體動(dòng)物：SPF級(jí)成年雌性SD大鼠60只，體重180～220 g，均購(gòu)自北京維通利華動(dòng)物公司。

1.2方法

1.2.1BMSCs的分離及培養(yǎng) 使用乙醚麻醉大鼠，然后脫頸處死大鼠，在無(wú)菌條件下將股骨和脛骨分離，暴露骨髓腔。用DMEM高糖培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，并收集沖洗液，1 000 r/min低溫離心10 min后棄去上清液，用10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。計(jì)數(shù)后按1×106cm2密度接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，48 h后進(jìn)行第1次換液，第2次以后間隔2～3 d換液1次。待細(xì)胞95%融合時(shí)，使用0.25%胰酶消化，按1∶2 的比例進(jìn)行傳代，細(xì)胞傳至第3代用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 SPF級(jí)健康成年雌性SD大鼠60只，體重180～220 g。在實(shí)驗(yàn)前讓大鼠自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。將60只SD雌性大鼠隨機(jī)分為3組，每組20只：對(duì)照組，模型組，BMSCs治療組。模型組使用MNU(4 mg/ml)膀胱灌注，2 mg/次，14 d/次，共4次。治療組在模型建立成功后的第28天經(jīng)尾靜脈注射BMSCs與DMEM懸液1.0 ml，對(duì)照組、模型組給予等劑量的生理鹽水。

1.2.3動(dòng)物模型制備 MNU溶液的配制，按照每只大鼠2 mg的劑量稱(chēng)取MNU，使用生理鹽水將溶液配成終濃度為4 mg/ml；大鼠采取腹腔麻醉法，使用10%水合氯醛，按照0.3 ml/100 g的劑量對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉；對(duì)大鼠的尿道口進(jìn)行常規(guī)消毒；將軟化的硬膜外導(dǎo)管從大鼠的尿道口后唇插入膀胱，插進(jìn)3～5 cm，將大鼠膀胱內(nèi)的尿液抽出；抽出尿液后緩慢注入已配制好的MNU溶液0.5 ml；操作完畢，未蘇醒的大鼠取仰臥位，模型組使用MNT(4 mg/ml)膀胱灌注，2 mg/次，14 d/次，共4次；對(duì)照組同法行等量的PBS灌注。第10周用脫臼法處死所有大鼠，將膀胱整個(gè)切除，肉眼觀察膀胱變化，在病變明顯處取材。

1.2.4RT-PCR檢測(cè)Notch1和Jagged1的基因表達(dá) 組織總RNA的提取：取膀胱組織約100 mg，將組織剪碎后放入勻漿器內(nèi)，加入1 ml預(yù)冷的Trizol，將組織打碎，裝入1.5 ml EP管中；加入300 μl的氯仿，充分混勻，12 000 r/min，4℃離心15 min；抽取上層水樣400 μl轉(zhuǎn)移到清潔的EP管中，加入400 μl異丙醇，12 000 r/min，4℃離15 min，離心結(jié)束后緩慢將上清倒掉，留取沉淀物；使用預(yù)冷的75%酒精，清洗1次，然后7 000 r/min，離心5 min；使用無(wú)酶槍頭，將75%酒精吸凈，室溫狀態(tài)下靜置5～7 min，使酒精充分揮發(fā)，剩余的沉淀加入25 μl RNase-free水進(jìn)行溶解。

PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系體積為50 μl，反應(yīng)體系內(nèi)容含有：反應(yīng)緩沖液、Taq DNA聚合酶、dNTPs、上下游引物及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物cDNA等，其中上下游引物各1 μl，模板cDNA為3 μl。加樣完成后振動(dòng)混勻，瞬間離心后，置于PCR儀擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：94℃變性20 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)30 s，72℃延伸30 s。

擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳：使用1%瓊脂糖凝膠，用Gelstain染料和凝膠成像系統(tǒng)顯色并采集圖片。使用IPP圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析測(cè)定，測(cè)量條帶灰度值，目的條帶與GAPDH條帶灰度值比值即為該目的基因的相對(duì)表達(dá)水平(相關(guān)引物見(jiàn)表1)。

1.2.5免疫印跡法檢測(cè)Notch1和Jagged1的表達(dá)量 將所獲取的大鼠膀胱組織從-80℃超低溫冰箱中取出，然后將腦組織剪碎，按照100 mg/ml的比例加入裂解液，12 000 r/min低溫離心15 min，然后凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。5% 脫脂奶粉 37℃ 封閉1.5 h，Ⅰ抗孵育，并在4℃環(huán)境下過(guò)夜，第二日Ⅱ抗孵育2 h。用ECL顯色液進(jìn)行曝光，使用Image J軟件進(jìn)行分析，以β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1BMSCs的形態(tài)學(xué)觀察 原代BMSCs在48 h之內(nèi)貼壁，以分散的克隆聚集方式增殖，細(xì)胞形態(tài)基本為均勻星形或梭形，核居中，偶有寬大扁平的多邊形細(xì)胞。經(jīng)過(guò)BMSCs純化，其他非貼壁細(xì)胞，通過(guò)換液逐漸減少。2周后原代細(xì)胞95% 融合，進(jìn)行傳代。傳代后細(xì)胞呈現(xiàn)漩渦狀和放射狀集落生長(zhǎng)傾向，隨著傳代次數(shù)增加，細(xì)胞形態(tài)更為均一，為梭形成纖維細(xì)胞樣(見(jiàn)圖1)。

表1合成PCR引物序列

Tab.1SynthesisofPCRprimersequences

GenePrimer sequencesAnnealingtemperatureLength ofproductNotch1GCAGGAGGGAGGTTTGTGAGGAGTATAACCTGACCATAGCAT56℃423 bpJagged1CTTCACGGGCACCATTCATCCGCAAAGTACACTGCACTAG55℃453 bpGAPDHGTGCTGAGTATGTCGTGGAGGTCTTCTGAGTGGCAGTGAT57℃301 bp

圖1 BMSCs的形態(tài)學(xué)觀察(×100)

圖2 大鼠膀胱形態(tài)學(xué)觀察

圖3 RT-PCR檢測(cè)各組Notch1、Jagged1的表達(dá)

2.2大鼠膀胱形態(tài)學(xué)觀察 模型組有15只大鼠膀胱可見(jiàn)明顯腫物，其中11只大鼠膀胱腫瘤為菜花樣，局部呈褐色，4只大鼠膀胱黏膜部分突起呈結(jié)節(jié)樣，邊界模糊，觸之較硬，與直腸前壁有黏連情況發(fā)生，2只大鼠可見(jiàn)較小乳頭狀腫物，未形成腫瘤的2只大鼠可見(jiàn)局部黏膜變厚，6只大鼠并發(fā)膀胱結(jié)石。

表2RT-PCR檢測(cè)Notch1和Jagged1在各組中的表達(dá)

Tab.2ExpressionofNotch1andJagged1ineachgroupdetectedbyRT-PCR

ControlModelDMSCs groupNotch10.433 2±0.0130.964 4±0.0180.717 9±0.0141)Jagged10.458 3±0.0120.988 7±0.0160.698 9±0.0131)

Note：Compared with model group,1)P<0.05.

圖4 Western blot檢測(cè)各組Notch 1、Jagged 1的表達(dá)

表3Westernblot檢測(cè)Notch1和Jagged1在各組中的表達(dá)

Tab.3ExpressionofNotch1andJagged1ineachgroupdetectedbyWesternblot

ControlModelBMSCsNotch10.523 6±0.0161.789 6±0.0261.129 6±0.0221)Jagged10.657 8±0.0181.645 8±0.0231.068 5±0.0201)

Note：Compared with model group,1)P<0.05.

對(duì)照組的10只大鼠膀胱標(biāo)本呈粉紅色，有光澤，未見(jiàn)腫物(見(jiàn)圖2)。

2.3Notch 1和Jagged 1的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組中，Notch1和Jagged1基因僅有微量的基礎(chǔ)表達(dá)。與對(duì)照組相比，模型組的表達(dá)明顯增高，同模型組相比較，治療組表達(dá)明顯下降(P<0.05)，但仍高于對(duì)照組(見(jiàn)圖3，表2)。

2.4Notch1和Jagged1的Western blot檢測(cè)結(jié)果 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，在對(duì)照組中，Notch1和Jagged1蛋白僅有微量的基礎(chǔ)表達(dá)，與對(duì)照組相比，模型組蛋白表達(dá)顯著升高，與模型組相比，治療組蛋白表達(dá)水平有所下調(diào)，但是仍高于對(duì)照組(見(jiàn)圖4，表3)。

3 討論

BMSCs是一種來(lái)源于骨髓的多功能細(xì)胞，擁有很強(qiáng)的自我更新以及多方向分化的能力，可以在內(nèi)環(huán)境的作用下遷移到受損組織，對(duì)組織的結(jié)構(gòu)以及功能進(jìn)行修復(fù)[8,9]；還具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)功能，在進(jìn)行異體移植時(shí)能夠有效避免免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生[10]。所以，BMSCs在臨床許多疾病的治療中都發(fā)揮關(guān)鍵性作用。研究證實(shí)，BMSCs在治療心臟、肝臟、肺、腎臟等器官損傷中發(fā)揮重要作用[11]。在腦損傷、腎性疾病等損傷模型中，BMSCs可以有效促進(jìn)損傷的修復(fù)[12]。因此，本實(shí)驗(yàn)選用BMSCs對(duì)膀胱癌進(jìn)行治療性實(shí)驗(yàn)研究，探討B(tài)MSCs在膀胱癌中的作用機(jī)制。

本研究采用經(jīng)尿道膀胱灌注MNU的方法制備大鼠膀胱癌模型。因?yàn)镸NU所引起的大鼠膀胱發(fā)生腫瘤的過(guò)程和人類(lèi)病變的過(guò)程相類(lèi)似，都是因尿中的化學(xué)物質(zhì)刺激膀胱上皮進(jìn)而引發(fā)的膀胱癌。所以，利用MNU制備的大鼠膀胱癌模型，能夠更好地對(duì)膀胱癌的病因及其病理過(guò)程有所了解和掌握，為膀胱癌的預(yù)防及治療提供更好的幫助。

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中模型組中有15只大鼠膀胱可見(jiàn)明顯腫物，說(shuō)明應(yīng)用經(jīng)尿道膀胱灌注MNU法構(gòu)建的大鼠膀胱癌模型是成功的，有利于我們進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展；RT-PCR結(jié)果顯示，在對(duì)照組中，Notch1和Jagged1基因的表達(dá)都相對(duì)比較微弱，模型組的表達(dá)明顯增高，而治療組的表達(dá)相比模型組有所降低，但仍高于對(duì)照組的表達(dá)。說(shuō)明因?yàn)榘┌Y病變的出現(xiàn)，模型組的基因表達(dá)出現(xiàn)了增高，而治療組表達(dá)降低，說(shuō)明在一定程度上，BMSCs對(duì)于膀胱癌的治療起到了積極作用；我們又通過(guò)Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Notch1和Jagged1蛋白的表達(dá)，在對(duì)照組中，Notch1和Jagged1蛋白的表達(dá)都相對(duì)較弱，模型組的表達(dá)則明顯增高，而治療組的表達(dá)相比模型組有所降低，但仍高于對(duì)照組。這也能夠說(shuō)明， BMSCs參與了對(duì)膀胱癌的治療，并達(dá)到了積極的效果。進(jìn)一步證實(shí)了BMSCs的及時(shí)應(yīng)用能夠給治療帶來(lái)積極的作用。本研究能夠充分表明，Notch1和Jagged1因子的表達(dá)直接反映了腫瘤的病變程度，BMSCs能夠影響Notch1和Jagged1的表達(dá)，說(shuō)明了BMSCs在膀胱癌的治療中起到了積極的作用。

綜上所述，本研究應(yīng)用經(jīng)尿道膀胱灌注MNU法成功構(gòu)建了大鼠膀胱癌模型，并且利用BMSCs對(duì)大鼠膀胱癌進(jìn)行干預(yù)治療，初步證實(shí)了BMSCs對(duì)大鼠膀胱癌的治療起到了一定的積極作用，為BMSCs的臨床應(yīng)用提供了有力的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。