RYR2基因新突變致心源性猝死一家系研究

申 童，喻青松，董颯英

（1．樂普（北京）醫療器械股份有限公司，北京 102200；2．北京化工大學生命學科學與技術學院，北京 100029）

心源性猝死（sudden cardiac death，SCD）是一種常見的死亡原因。據不完全統計，我國的SCD發病率約為每十萬人41.8[1]，每年發生的SCD病例約為50萬。

遺傳性心臟病主要包括原發性心電疾病與遺傳性結構性心臟病兩大類，具有高度的SCD風險。原發性心電疾病包括長QT綜合征、Brugada綜合征、短QT綜合征、兒茶酚胺敏感性多形性室速等，遺傳性結構性心臟病包括肥厚型心肌病、擴張型心肌病、致心律失常性右室心肌病、限制型心肌病等[2-4]。隨著醫學與分子遺傳學研究的發展與不斷深入，基因突變被證實與遺傳性心臟病的發生和發展密切相關，基因檢測成為對此類疾病進行明確診斷的必要手段，對SCD高危患者通過早期的基因篩查也有助于SCD的預防、危險分級與治療。

靶向測序是將感興趣的基因區域通過靶向捕獲進行富集后再進行高通量測序的研究策略[5]，相較于全外顯子測序其成本較低、目標區域測序深度高、所需時間短，更有利于研究特定區域的遺傳變異。本研究利用靶向測序技術對1例SCD進行基因檢測，以期發現致病突變，為進一步探索SCD的分子病理和發病機制提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 也拿走了

猝死病例1例，男，54歲。運動后突然倒地死亡，生前具有勞動性呼吸困難、胸痛等癥狀，就醫時排除了冠心病、高血壓等疾病的可能性，但是未能得到明確診斷。通過詢問其親屬，發現家族中多人具有勞動性呼吸困難的癥狀，因此高度懷疑是基因突變所致。同時入組262名健康對照人群。

1.2 基因檢測

從外周血白細胞中提取基因組DNA，通過靶向測序對69個SCD相關基因（ABCC9，ACTC1，ACTN2，AKAP9，ANK2，BAG3，CACNA1C，CACNA2D1，CACNB2，CASQ2，CAV3，CRYAB，CSRP3，DES，DMD，DSC2，DSG2，DSP，FKTN，GLA，GPD1L，HCN4，JPH2，JUP，KCND3，KCNE1，KCNE2，KCNE3，KCNE5，KCNH2，KCNJ2，KCNJ5，KCNJ8，KCNQ1，LAMP2，LDB3，LMNA，MYBPC3，MYH6，MYH7，MYL2，MYL3，MYOZ2，MYPN，NEBL，NEXN，PKP2，PLN，PRKAG2，RANGRF，RYR2，SCN1B，SCN2B，SCN4B，SCN5A，SGCD，SNTA1，TAZ，TCAP，TMEM43，TMPO，TNNC1，TNNI3，TNNT2，TPM1，TRDN，TRPM4，TTN，VCL）進行檢測。基因組DNA超聲片段化后，利用DNA探針（Roche，Switzerland），富集包含目標區域的基因組DNA片段，并且構建DNA文庫，利用Illumina二代測序平臺（IlluminaInc，USA）進行大規模平行測序。所得測序數據通過BWA（0.7.12）軟件與人類基因組參考序列（GRCh37/hg19）進行拼接比對，并利用GATK軟件尋找目標區域的變異。排除1000 Genomes Project （T1GP；http://www.1000genomes.org/）[6]和Exome Aggregation Consortium（ExAC；http://exac.broadinstitute.org/about）[7]中人群頻率高于1%的堿基改變。符合上述標準的非同義突變通過Sanger測序進行確認。PCR擴增RYR2基因第31號外顯子，上游引物為：5' ATCGCTTCTTCGTTTGCTA 3'；下游引物為：5'GACCCTTTACTCTGGACTGT 3'。PCR 純化后Sanger測序確定突變。

2 結 果

2.1 基因檢測結果

受檢者攜帶RYR2基因上的錯義突變c.G4107C（p.E1369D），該突變位于RYR2基因的第31號外顯子，第1369位谷氨酸（E）變成天冬氨酸（D），突變基本信息見表1。受檢者親屬中也有多位攜帶此突變（圖1-A，1-B）。該突變目前沒有相關報道，致病性未知，同時在262例對照組中也沒有檢測到這一突變。但是通過不同物種RYR2基因編碼氨基酸的保守型分析可以發現，此突變位于RYR2的保守序列（圖1-C），因此突變致病的可能性較高。

2.2 臨床表現

受檢者生前及其親屬的臨床表現見表2。受檢者A于45歲時，因勞動性呼吸困難、胸痛及一過性暈厥等癥狀就診，心電圖顯示竇性心動過速，超聲心動圖結果正常，未能明確診斷。受檢者多名親屬存在勞動性呼吸困難、胸痛、心律失常等癥狀，由于當地醫療條件所限以及個人健康意識缺乏，這些親屬當時并沒有得到明確診斷，也沒有采取必要的預防措施。

表1 受檢者攜帶突變的相關信息

圖1 （A） RYR2基因p.E1369D位點Sanger驗證；（B）受檢者遺傳家系圖；（C）RYR2基因p.E1369D保守型分析

表2 受檢者及其親屬臨床表現

3 討 論

本例SCD死者在疲勞狀態下突然倒地，迅速死亡，符合心源性猝死的發病特征。死者生前長時間存在勞動性呼吸困難、胸痛等癥狀，但是由于所在地區醫療條件所限，僅排除了冠心病、高血壓等疾病的可能性，未能明確確診。

通過對受檢者親屬健康信息的咨詢，我們高度懷疑此例SCD是由基因突變引起的，隨后的基因檢測結果以及家系的遺傳分析也證實了這一點。我們將這一結果反饋給了死者親屬，但是親屬因心理壓力未能配合進行進一步檢測，所以我們未能對這一突變導致的遺傳性心臟病進行明確診斷。

RYR2基因編碼的蛋白——蘭尼丁受體蛋白是心肌細胞肌漿網上的鈣離子釋放通道，作為重要的一員參與心肌興奮-收縮偶聯過程[8-10]。RYR2是目前在細胞內發現的最大的離子通道蛋白，與CPVT、ARVC及特發性心室顫動相關的RYR2基因突變多達100多個，且多集中于發現的3個突變集簇Hot domain（氨基酸殘基1-466，246-2534，3778-4201）[11-12]。本例SCD死者攜帶的突變就位于其中一個Hot domain內。

本次研究確認RYR2基因的c.G4107C（p.E1369D）突變可能是一個導致心源性猝死的致病突變。在先證者的多位親屬中也發現了這一突變，我們建議親屬中的突變陽性個體及早采取干預措施，防治惡性心律失常的發生。此外，基因篩查對受檢者親屬生育下一代提供了遺傳咨詢依據，幫助優生優育。