新疆維吾爾族、漢族抗結核藥物性肝損傷患者IL-10分泌水平的研究

劉 向, 楊 麗, 鄭 甜, 陳偉嵐, 李國昌

(1. 新疆維吾爾自治區(qū)胸科醫(yī)院結核科，新疆 烏魯木齊 830049； 2. 新疆維吾爾自治區(qū)胸科醫(yī)院藥劑科，新疆 烏魯木齊 830049； 3. 石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院藥劑科，新疆 石河子 832008)

抗結核藥物所導致肝損傷(anti-tuberculosis drug-induced liver injury，ATDLI)常使抗結核治療中斷，或使治療方案更改，導致患者療效降低和結核分枝桿菌產(chǎn)生耐藥等，直接影響對結核病的控制效果。隨著人們對藥物性肝損傷研究的不斷深入，參與肝損傷疾病的細胞因子的分泌量越來越引起人們的關注，免疫細胞在活化過程中釋放的細胞因子在肝損傷機制中發(fā)揮著重要作用[1]。其中白介素-10(interleukin-10，IL-10)是一種重要的細胞因子，有研究報道IL-10作為一種抗炎因子，參與多種免疫炎癥的病理過程，肝組織可分泌IL-10對抗細胞色素酶介導的藥物免疫毒性和細胞毒性，抑制炎癥介質(zhì)、氧自由基等的釋放[2-3]。并且人們發(fā)現(xiàn)細胞因子不同的基因型呈現(xiàn)不同的表達量，且不同人群IL-10多態(tài)性的分布存在差異[4]。IL-10的分泌量受基因的調(diào)控，由于不同種族人群的基因存在差異，因此其IL-10水平亦不同。

全國結核病流行病學調(diào)查結果顯示，新疆是全國結核病高流行區(qū)，不同民族的結核病發(fā)病率也存在差異，維吾爾族發(fā)病率高于漢族和其他少數(shù)民族人群[5]。對此，本項目在等同的實驗條件下檢測新疆區(qū)域內(nèi)維吾爾族與漢族人群中ATDLI患者IL-10分泌水平，同時與肺結核患者血清IL-10分泌水平比較，從而探討兩民族患者由于病情變化而導致IL-10分泌水平的變化及其在肝損傷中的臨床意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象 納入石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院、新疆維吾爾自治區(qū)胸科醫(yī)院2015年1月—2016年11月確診為ATDLI患者。維吾爾族為ATDLI患者均篩選新疆區(qū)域內(nèi)原居住者，雙親無異族通婚史。項目通過石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 診斷標準

1.2.1 肺結核診斷標準 依據(jù)中華醫(yī)學會結核病分會制定的《肺結核診斷和治療指南》[6]進行肺結核的診斷。

1.2.2 ATDLI患者確診 結核病患者在接受抗結核藥物治療過程中出現(xiàn)肝損傷，并且與抗結核藥物的使用直接相關，診斷依據(jù)滿足《抗結核藥所致藥物性肝損傷診斷與處理專家建議》[7]的相關條件。

1.2.3 肝損傷嚴重程度分級標準 依據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理局(State Food and Drug Administration, SFDA)藥品評價中心(Center for Drug Reassessment，CDR)制定的《抗結核藥所致藥物性肝損傷診斷與處理專家建議》對肝損傷嚴重程度進行分級[7]。

1.2.4 ATDLI患者納入標準 經(jīng)確診的肺結核患者在抗結核藥物治療前臨床生化檢查均正常，包括血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、堿性磷酸酶(AKP)和總膽紅素(TBiL)均在正常范圍內(nèi)(ALT<40 U/L，AST<40 U/L，AKP<150 U/L，TBiL<23.1 μmol/L)[8-9]。經(jīng)抗結核藥物治療且在抗結核藥物治療過程中出現(xiàn)肝損傷，并確保在抗結核藥物治療過程中未合并服用可導致肝損傷的其他藥物。

1.2.5 抗結核藥物繼發(fā)肝損傷患者排除標準 (1)HIV感染、慢性嗜肝病毒感染的肝炎患者；(2)抗結核治療前患者ALT、AST或TBiL檢測結果非正常參考范圍內(nèi)；(3)合并自身免疫性肝炎、HIV感染、酒精性肝病、腫瘤、糖尿病、心腦血管疾病及其他感染性疾病；(4)由其他藥物導致肝功能損傷的患者。

1.3 試劑及儀器 IL-10 ELISA試劑盒為R&D公司產(chǎn)品(批號330244)，Thermo Varioskan Flash酶標儀為Thermo Scientific公司產(chǎn)品，TGL-16B型離心機為上海安亭科學儀器廠產(chǎn)品，恒溫水浴鍋為江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠產(chǎn)品。

1.4 研究方法

1.4.1 標本采集 在接受抗結核藥物治療過程中發(fā)生肝損傷患者于清晨空腹抽取靜脈血2 mL，4 000 r/min 離心5 min，分離血清，置于-20℃保存待檢測。

1.4.2 檢測方法 采用ELISA試劑盒(IL-10 ELISA Kit)測定肝損傷患者IL-10分泌量，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，應用 Thermo Varioskan Flash酶標儀在450 nm處測定OD值，標準曲線濃度分別為：500、250、125、62.5、31.2、15.6、7.8 pg/mL，相關系數(shù)(r2)=0.9998，變異系數(shù)(CV)=0.0879。在570 nm處波長處進行校正，結果用四參數(shù)擬合曲線進行計算，根據(jù)標準曲線公式計算出IL-10的濃度。

2 結果

2.1 基本資料 本研究共納入ATDLI漢族組患者100例(男性67例，女性33例)，維吾爾族組患者135例(男性73例，女性62例)。年齡18～65歲，漢族組患者平均年齡(38.02±15.77)歲，維吾爾族組患者(40.53±16.44)歲；體重：漢族組(59.35±10.23)kg，維吾爾族組(58.39±12.97)kg；身高：漢族組(168.30±7.98)cm，維吾爾族組(166.02±7.83)cm；ALT：漢族組[127.3(80～394)]U/L，維吾爾族組[113.2(80～450)]U/L；AST：漢族組[156.5(40～360)]U/L，維吾爾族組[135.7(40～432)]U/L；兩組患者抗結核藥物治療方案均為異煙肼片(H)+利福平(R)+吡嗪酰胺片(Z)+鹽酸乙胺丁醇片(E)或 H+R+Z 或H+R+E。兩組患者的性別構成比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；兩組患者的年齡、體重、身高、ALT、AST比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2 漢族與維吾爾族肝損傷患者IL-10分泌量 檢測顯示漢族組、維吾爾族組ATDLI患者 IL-10分泌量分別為(45.81±11.04)、(56.30±17.24)pg/mL。維吾爾族組患者高于漢族組患者，差異有統(tǒng)計學意義(t=5.28，P<0.0001)。

2.3 不同性別的漢族、維吾爾族ATDLI患者IL-10分泌水平 漢族組、維吾爾族組ATDLI患者不同性別的血清IL-10相比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

組別IL-10tP漢族組0.1030.935 男46.99±12.40 女47.28±14.81維吾爾族組0.9390.305 男57.20±18.28 女 54.44±15.47

2.4 漢族、維吾爾族ATDLI患者不同肝損傷程度的IL-10分泌量 按肝損傷嚴重程度分級標準，根據(jù)ALT值將ATDLI患者分為輕度(ALT值80～120 U/L)、中度(ALT值120～200 U/L)和重度(ALT值>200 U/L)肝損傷三組。漢族組、維吾爾族組ATDLI患者輕度、中度、重度肝損傷構成及IL-10分泌量見表2。漢族組、維吾爾族組ATDLI患者不同程度肝損傷構成比較，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=3.137，P=0.208)。

組間兩兩比較顯示，漢族組、維吾爾族組重度肝損傷患者IL-10的分泌量均高于輕度肝損傷患者(均P<0.05)；而中度肝損傷患者與輕度、重度肝損傷患者之間比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。兩個民族ATDLI患者隨著肝損傷程度加重，抑炎因子IL-10的分泌量逐漸升高。見圖1。

表2漢族、維吾爾族ATDLI患者輕度、中度、重度肝損傷構成及IL-10分泌量

Table2Constituent and secretion level of IL-10 in Han and Uyghur nationality patients with slight, moderate and severe ATDLI

肝損傷程度例(%)IL-10(pg/mL)漢族組 重度10(10.0)49.52±13.21 中度18(18.0)47.39±10.58 輕度72(72.0)44.73±9.10維吾爾族組 重度22(16.3)58.62±14.38 中度30(22.2)56.84±13.71 輕度83(61.5)52.30±15.24

*：漢族輕度組與重度組比較，P<0.05；●：維吾爾族輕度組與重度組比較，P<0.05

3 討論

隨著對細胞因子研究的深入，發(fā)現(xiàn)在肝損傷的發(fā)病機制中，免疫反應中的細胞因子發(fā)揮著重要的作用。IL-10的分泌量與結核免疫力缺乏相關，其可調(diào)節(jié)促炎癥因子CD4+T輔助細胞反應[10-11]。并有文獻顯示IL-10通過多種調(diào)節(jié)機制參與肝纖維化的發(fā)展，在炎癥因子所致的肝纖維化中具抗纖維化作用，結果表明慢性肝炎患者血清IL-10濃度高于對照組，且不同損傷程度的患者體內(nèi)IL-10濃度重度組高于輕度、中度組，認為IL-10參與肝慢性損傷的病理過程，且隨著反映肝損傷嚴重程度的指標升高而升高[12]。本研究結果顯示，漢族、維吾爾族ATDLI輕度組患者IL-10分泌量均低于重度組(P<0.05)。并且本課題組前期對254例(漢族132例，維吾爾族122例)肺結核患者在服用抗結核藥物治療后，非ATDLI患者血清IL-10表達水平的研究顯示：維吾爾族患者高于漢族[13]。本次對ATDLI患者IL-10分泌水平的研究結果同樣是維吾爾族患者高于漢族。將本次結果與前期結果[13]整合分析發(fā)現(xiàn)：漢族、維吾爾族ATDLI患者IL-10分泌水平均高于結核病患者(P<0.0001)。反映出IL-10分泌量的增加與藥物性肝損傷的發(fā)生相關，隨著血清ALT、AST的升高，血清IL-10也伴隨升高。這也與文獻[12]報道的結果吻合。

IL-10的主要生物學功能是抑制和終止體內(nèi)的炎癥反應，對所有的促炎性細胞因子從合成到釋放幾乎都有抑制作用，參與多種免疫炎癥的病理過程[14-15]。研究[16]表明IL-10的分泌水平75%是由遺傳決定的，而且主要受轉錄水平的控制。本項目前期對漢族(124例)、維吾爾族(131例)健康人群IL-10基因多態(tài)性與分泌量的相關性研究[17]顯示：IL-10的-1082G/A、-819C/T、-592C/A位點基因型在漢族與維吾爾族人群的總體分布均有統(tǒng)計學差異(P<0.001)，其中-1082位點的AA型和AG型在兩民族間分布有差異，但AA型更顯著(OR=5.49)，漢族人群AA基因型頻率高于維吾爾族人群(P<0.001)，漢族-819位點TT基因型和-592位點AA基因型頻率的分布高于維吾爾族(P=0.02)；維吾爾族人群-1082位點AG型、-819和-592位點CC基因型頻率的分布高于漢族(P<0.001)。對各位點等位基因進行卡方檢驗，發(fā)現(xiàn)-1082G/A位點維吾爾族人群等位基因G(25.57%)高于漢族(7.26%)，-819C/T和 -592C/A位點維吾爾族人群等位基因C(50.38%)高于漢族(32.66%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。

而 IL-10啟動子區(qū)-1082、-819、-592這三個位點基因多態(tài)性對體內(nèi)IL-10水平的變化會產(chǎn)生影響，研究[18]顯示-1082位點位于Ets轉錄因子結合序列，該位點G等位基因體內(nèi)IL-10水平傾向于高表達，而A等位基因則傾向于IL-10低水平表達。同樣前期的結果[17]也證實GCC為高分泌型，ATA為低分泌型，ACC的表達水平介于前兩者之間。維吾爾族-1082位點的AG型、-819位點的CC和CT型、-592位點的CC和CA型血清IL-10濃度高于漢族(P<0.05)。體內(nèi)IL-10的分泌水平主要受遺傳因素的調(diào)控在不同人群間呈現(xiàn)出差異[19-20]。當攜帶GCC等位基因型時，IL-10的表達較高；當攜帶ATA等位基因型時細胞因子IL-10的表達較低。

新疆靠近中亞，作為古絲綢之路的重要通道，由于遷移、婚配等原因使維吾爾族融合有30%左右的高加索人種血緣[21]。與漢族人群在體質(zhì)和遺傳距離上有明顯不同[22-23]。本文對漢族與維吾爾族ATDLI患者血清IL-10分泌量的研究顯示：維吾爾族患者IL-10的分泌水平高于漢族受試患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示這應與兩個民族人群的遺傳基因多態(tài)性相關。由于受試患者的樣本數(shù)量有限，僅對ATDLI患者IL-10的分泌量進行了探討，其民族間IL-10分泌水平差異的機制尚需更大群體樣本進一步的研究予以證實。

本試驗通過檢測漢族與維吾爾族ATDLI患者體內(nèi)IL-10分泌水平，研究其在肝損傷患者體內(nèi)的變化以及在不同民族間表達水平的差異，將有利于探討細胞因子在結核病患者體內(nèi)的表達特點，為疾病的診斷、治療及愈后觀察提供基礎數(shù)據(jù)。