早期結直腸癌血清自身抗體的研究進展△

劉書霞，韓曉紅

國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心/中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院腫瘤醫(yī)院檢驗科，抗腫瘤分子靶向藥物臨床研究北京市重點實驗室，北京 1000210

結直腸癌是常見的惡性腫瘤之一，根據(jù)中國2014年腫瘤登記數(shù)據(jù)顯示：結直腸癌的發(fā)病率和病死率在中國惡性腫瘤中分別居第3位和第5位，其中，新發(fā)病例數(shù)約為37萬例，死亡病例數(shù)為18萬例，分別占總新發(fā)病例數(shù)和死亡病例數(shù)的9.73%和7.84%[1]。早期結直腸癌患者多無明顯癥狀，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已屬于中晚期，因此，早期發(fā)現(xiàn)和早期治療對于提高結直腸癌患者的生存率尤為重要。目前，臨床上結直腸癌的診斷方法主要是結腸鏡檢查，但是該檢查方法為有創(chuàng)性檢查，伴有出血、穿孔等并發(fā)癥的風險，在臨床應用時具有較多的禁忌證，且檢測成本較高，患者的耐受性也較差[2]。因此，可靠的無創(chuàng)性檢查更適合用于早期檢測，但是常見的糞便隱血試驗和血清學腫瘤標志物癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）和糖類抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）等指標在早期檢測中的特異度和靈敏度均較低，限制了其作為早期篩查結直腸癌指標的臨床應用價值。隨著分子生物學和高通量檢測技術的飛速發(fā)展，新型腫瘤標志物不斷出現(xiàn)，自身抗體就是目前備受關注的一種腫瘤標志物。早在1971年，Taylor和Odili[3]就已發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者體內存在抗腫瘤抗原的自身抗體。雖然腫瘤自身抗體產(chǎn)生的機制尚不明確，但是，同腫瘤相關抗原一樣，它與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關[4]。近年來，已有多項研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤患者的血清甚至癌前病變患者的血清中能夠檢測到自身抗體的存在[5-6]，并探索了其在一些腫瘤（如乳腺癌、非小細胞肺癌、肝癌等）的診斷、治療和預后中的作用[7-9]，因此，自身抗體可能是較有前景的、可用于腫瘤早期檢測和動態(tài)監(jiān)測的生物標志物，為腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療提供參考。本文就結直腸癌患者血清中的自身抗體進行簡要闡述。

1 腫瘤血清自身抗體的檢測方法

腫瘤血清自身抗體的檢測方法主要包括酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和蛋白質印跡法（Western blotting）。新涌現(xiàn)的技術，如血清學篩選互補DNA表達文庫（serological screening of cDNA expression library，SEREX）技術、噬菌體展示技術、蛋白微陣列技術、反向捕獲蛋白芯片技術、血清蛋白組分析技術、多親和性蛋白圖譜技術等，逐漸被用于自身抗體的篩選和定量檢測[10]。Babel等[11]應用蛋白芯片技術同時篩選8000種蛋白，最終鑒定結果顯示，促分裂原活化的蛋白激酶激活的蛋白激酶3（mitogen-activated protein kinase-activated protein kinase 3，MAPKAPK3）自身抗體和激活素A受體2B（activin A receptor type 2B，ACVR2B）自身抗體聯(lián)合檢測對結直腸癌的診斷效能更好，靈敏度和特異度分別是83.3%和73.9%。

2 結直腸癌相關抗原的血清自身抗體

2.1 抗p53蛋白自身抗體

p53是一種腫瘤抑制基因，其介導的細胞信號轉導通路在調節(jié)細胞的正常活動中發(fā)揮著重要的作用。在所有惡性腫瘤中，多數(shù)會出現(xiàn)該基因的突變，這是腫瘤中常見的遺傳學突變。p53基因突變后導致p53蛋白過表達或p53蛋白在腫瘤細胞的細胞質或細胞核中堆積，最終導致p53蛋白具有免疫原性，機體產(chǎn)生針對p53蛋白的自身抗體（antip53 antibody，Ap53Ab）。Ap53Ab是目前研究較廣泛的腫瘤自身抗體之一，并作為新型的腫瘤標志物存在于多種腫瘤中。研究發(fā)現(xiàn)，在早期結直腸癌患者中，Ap53Ab檢測的靈敏度高于CEA和CA19-9，認為其可能對早期結直腸癌的篩查具有重要意義[12-13]。在最近的一項關于Ap53Ab和結直腸癌關系的研究中發(fā)現(xiàn)，早期（0～I期）結直腸癌患者（n=168）中Ap53Ab、CEA和CA19-9檢測的陽性率分別為16.7%、12.5%和11.3%，進一步表明Ap53Ab在早期結直腸癌檢測中的陽性率高于常規(guī)腫瘤標志物，可能成為結直腸癌早期篩檢的血清學標志物，具有良好的前景。但是，由于Ap53Ab是免疫球蛋白G （immunoglobulin G，IgG）類抗體，半衰期約為21天，抗體陽性的患者在手術后恢復至正常水平至少需要6個月，甚至是5年，因此，術前檢測血清中的Ap53Ab更具有意義[14]。

2.2 抗CEA自身抗體

CEA是一類分子量為180～200 kDa的多糖蛋白復合物，在健康人血清中的表達水平較低，主要在胚胎發(fā)育階段和腫瘤組織中表達，目前作為結直腸癌常見的血清學標志物被廣泛應用。但是，CEA主要在結直腸癌晚期患者的血清中升高，而在結直腸癌早期患者中的陽性率較低。有研究發(fā)現(xiàn)，消化系統(tǒng)腫瘤患者的血清中存在CEA抗體，甚至在腫瘤早期CEA正常的患者體內也能夠檢測到CEA抗體[15]。Castaldi等[16]發(fā)現(xiàn)結直腸癌患者血清中CEA單體和CEA-IgM免疫復合物檢測的陽性率分別為43%和38%，而二者聯(lián)合檢測的陽性率達64%，而在早期結直腸癌患者血清中CEA和CEA-IgM陽性率分別為8%和29%。因此，CEA抗體比CEA對早期結直腸癌更敏感，且二者聯(lián)合檢測對結直腸癌的早期檢測可能更具有意義。

2.3 抗黏蛋白自身抗體

黏蛋白（mucin，MUC）是一組高度糖基化的不同糖蛋白的總稱，包括MUC2、MUC5AC、MUC5B和MUC6等，由特殊上皮細胞——杯狀細胞分泌，廣泛覆蓋在管狀器官如氣管、支氣管、胃腸道和生殖道等上皮細胞表面，主要起到細胞保護、細胞識別和黏液維持等作用。MUC多樣化的生物學功能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。Kocer等[17]報道了MUC5AC抗體在健康受試者、結直腸息肉和結直腸癌患者血清中的表達及與結直腸癌預后的關系，結果發(fā)現(xiàn)，在結直腸癌患者中MUC5AC抗體的水平較高，并且MUC5AC抗體陽性患者的預后較差，無病生存期和總生存期均較短。

2.4 抗凋亡抑制蛋白自身抗體

凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）是一類高度保守的內源性抗細胞凋亡抑制蛋白家族，主要通過抑制胱天蛋白酶（caspase）活性和參與調節(jié)核因子кB（nuclear factor kappalightchain-enhancer of activated B cell，NF-кB）的表達從而抑制腫瘤細胞的凋亡。存活蛋白（survivin）、黑色素瘤凋亡抑制蛋白（livin）和X連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）是IAP家族的重要成員，并且是多種凋亡刺激物的負調控因子。相關研究表明，IAP在多種腫瘤中的表達水平明顯增高[18-19]，且腫瘤患者體內存在針對這些IAP的自身抗體[20-22]。El Ali等[23]發(fā)現(xiàn)胃腸道腫瘤和健康者的血清livin抗體水平存在明顯差異，并采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western blotting證實了livin抗體的存在。Hosono等[24]通過檢測62例健康人、240例結直腸息肉和176例結直腸癌患者血清中survivin、livin和XIAP這3種IAP抗體的水平，同時對p53抗體、CEA和CA19-9進行檢測和比較，結果發(fā)現(xiàn)，在早期結直腸癌患者中，血清survivin抗體和p53抗體聯(lián)合檢測的陽性率最高（35.6%），提示二者聯(lián)合檢測可能是早期結直腸癌檢測的重要標志物。

2.5 自身抗體聯(lián)合檢測

針對結直腸癌進行研究的自身抗體種類還有很多，如c-myc、NY-ESO-1、組蛋白脫乙酰基酶5（histone deacetylase 5，HDAC5）、p62等[25-29]，雖然自身抗體對腫瘤的檢測具有較高的特異度，但單一指標檢測具有較低的靈敏度，因此，目前大多數(shù)研究已經(jīng)開展多個指標聯(lián)合檢測，以探索在不降低特異度的情況下提高檢測靈敏度的最佳組合。Negm等[30]運用蛋白芯片技術同時檢測32個自身抗體，最終篩選出6個具有代表性的自身抗體[甲胎蛋白（alpha-fetal protein，AFP）、p53、K-Ras、NYCO-16、RAF1、Annexin]。以這 6個自身抗體為一個檢測組合在100例結直腸癌患者和100例健康人中進行檢測，發(fā)現(xiàn)單一抗體的陽性率為18%～41%，特異度為94%～96%，而這6個自身抗體聯(lián)合檢測的靈敏度可達到75%。因此，與單一指標檢測相比，自身抗體的聯(lián)合檢測可以較大幅度地提高檢測結直腸癌的靈敏度。

3 討論

隨著個體化醫(yī)學、精準醫(yī)學時代的到來以及各種技術的蓬勃發(fā)展和對腫瘤的深入研究，出現(xiàn)了新的結直腸癌治療策略，但是，如何早期、準確地發(fā)現(xiàn)腫瘤仍然是臨床的一大難題。血清腫瘤標志物一直是腫瘤研究領域的熱點和難點。然而，常規(guī)應用于臨床的腫瘤相關抗原（如CEA、CA19-9等）對腫瘤診斷的靈敏度和特異度并不高，并且主要在腫瘤晚期出現(xiàn)，常用于結直腸癌患者的療效監(jiān)測。而多項研究表明，結直腸癌患者血清中存在多種抗腫瘤相關抗原的自身抗體，例如，在結直腸癌患者的血清中發(fā)現(xiàn)抗p53蛋白抗體，并且與CEA和CA19-9相比，抗p53蛋白抗體對結直腸癌的檢測具有更高的陽性率，尤其是在結直腸癌早期。更有趣的是，大多數(shù)自身抗體在結直腸癌早期和晚期階段的陽性率是相似的，也正是這一特點使得自身抗體或許能成為有前景的早期檢測的腫瘤標志物[14,31-32]。目前報道的單一自身抗體檢測靈敏度大于60%，特異度大于80%的僅有CEA抗體[15]、CCDC83抗體[33]、SPAG9抗體[34]和RPH3AL抗體[35]，并不具備足夠的靈敏度，因此，通過篩選最佳組合進行聯(lián)合檢測顯得尤為重要。目前應用多個自身抗體聯(lián)合檢測或自身抗體與腫瘤相關抗原標志物聯(lián)合檢測，可以實現(xiàn)在盡量不降低特異度的情況下提高腫瘤的檢出率。另外，雖然自身抗體標志物的器官特異性較差，并不能夠辨別腫瘤的具體發(fā)生部位，但自身抗體升高的意義更在于可以預示著腫瘤的發(fā)生。雖然自身抗體在腫瘤的早期檢測方面具有諸多優(yōu)勢，且目前這方面的研究甚多，但仍存在一些研究間的差異，如因研究人群、研究設計、樣本量大小、檢測方法、檢測試劑盒及界定為檢測陽性的cut-off值的定義不同等，導致不同研究中自身抗體對結直腸癌的診斷效能存在很大差異。如Chen等[36]的研究結果顯示，血清中p53自身抗體診斷結直腸癌的特異度可以達到100%，但是其靈敏度僅為8.2%，而在多項研究中，p53抗體的檢測靈敏度均在20%左右[25,37-38]。綜上所述，與傳統(tǒng)的血清學標志物相比，自身抗體對結直腸癌的早期檢測具有一定的優(yōu)勢，在今后的研究中應進一步挖掘新的、有價值的自身抗體和探索聯(lián)合檢測的最佳組合。同時應該考慮到目前研究間存在的一些差異因素，設計較為完善的研究方案，以期使自身抗體的研究結果能夠盡早地轉化到臨床運用中來。