宮頸病變組織中CDC7和PHH3蛋白的表達及臨床意義△

王海燕，丁燕青海大學附屬醫院婦科，青海 西寧 810001

2甘肅省腫瘤醫院婦瘤科，甘肅 蘭州 7300300

宮頸癌是女性生殖系統最常見的惡性腫瘤之一，其發病的年輕化趨勢越來越明顯，嚴重危害女性的身體健康和生活質量。宮頸癌主要與高危型人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染有關，HPV感染可導致細胞周期調控失常并發生惡性轉移[1]。目前，規范化的宮頸癌篩查可顯著降低其發病率，但仍會出現細胞學和HPV檢查假陰性的問題，因此，對宮頸癌進行早期診斷及預后評估仍是一個亟待解決的問題。磷酸化組蛋白H3（phospho histone H3，PHH3）是一種抗磷酸化的組蛋白H3的抗體[2]，組蛋白H3的磷酸化與有絲分裂染色體的濃縮相關，且其表達水平與腫瘤的惡性程度呈正相關，是一個具有潛在價值的腫瘤標志物，與腫瘤的預后密切相關。細胞周期的失調可導致腫瘤細胞的生長，且對腫瘤的生物學行為及預后有重要意義[3]。研究顯示，細胞分裂周期蛋白7（cell division cycle protein 7，CDC7）在多種腫瘤細胞中高表達，在所有轉移腫瘤細胞中也均顯示高表達，使其成為目前腫瘤研究的重要標記和靶點[4]。表明CDC7蛋白是腫瘤發生、發展過程中的關鍵調控因子。目前，國內關于宮頸癌PHH3與CDC7的表達水平及其相關性的研究較少。本研究探討不同宮頸病變組織中CDC7及PHH3的表達水平，分析其與宮頸癌臨床特征的關系，為宮頸癌的早期診斷提供理論依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2016年8月至2017年5月在青海大學附屬醫院接受病理組織學檢測的宮頸疾病患者的組織標本。納入標準：所有患者均經病理活檢證實為宮頸鱗癌、宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）或宮頸炎。排除標準：①宮頸鱗癌患者術前接受放化療及免疫治療；②合并其他系統惡性腫瘤的患者。依據納入和排除標準，共納入144例宮頸疾病患者，年齡21～78歲，平均年齡（48.2±5.6）歲。宮頸脫落細胞學檢查：陰性28例，無明確意義的不典型鱗狀上皮細胞（atypical squamous cells of undetermined significance，ASCUS）16例，低度鱗狀上皮內病變（low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）32例，不除外高度鱗狀上皮內病變的不典型鱗狀上皮細胞（atypical squamous cells-cannot exclude high-grade squamous intraepithelial lesion，ASC-H）40例，高度鱗狀上皮內病變（highgrade squamous intraepithelial lesion，HSIL）28 例 。病理學檢測結果：正常宮頸組織28例，CINI級30例，CINⅡ～Ⅲ級32例，宮頸鱗癌44例，宮頸腺癌10例。根據病理學檢測結果，本研究共納入54例宮頸癌患者，年齡：＜55歲24例，≥55歲30例；病理分級：高34例，低中20例；淋巴結轉移：無18例，有36例；臨床分期：I～Ⅱ期23例，Ⅲ～Ⅳ期31例。

1.2 主要試劑

兔抗人CDC7單克隆抗體[稀釋濃度為（1∶50）～（1∶500）]購自美國Santa Cruz公司，兔抗人PHH3單克隆抗體（稀釋濃度為1∶200）購自北京中杉金橋生物技術有限公司。免疫組織化學試劑盒、二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色劑均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 免疫組織化學染色法檢測CDC7和PHH3蛋白表達情況

免疫組織化學染色法檢測144例宮頸病變患者宮頸組織中CDC7和PHH3蛋白的表達情況。取組織標本常規脫水包埋，5 μm連續切片，二甲苯脫蠟5 min，重復3次。乙醇梯度水化，3%過氧化氫溶液室溫孵育10 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）沖洗 5 min，重復 3次。滴加5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶液，37℃孵育30 min。滴加一抗（稀釋濃度為1∶100），4 ℃孵育過夜，PBS沖洗5 min，重復3次，滴加二抗室溫孵育30 min，DAB溶液顯色，鏡下觀察顯色反應，顯色結束后置于流動水沖洗，蘇木素復染。以PBS代替一抗作為陰性對照，以已知CDC7和PHH3陽性表達的宮頸病變組織作為陽性對照。采用累積光密度（integrated optical density，IOD）值表示 CDC7和 PHH3蛋白的表達水平。

1.4 結果判定

宮頸組織CDC7和PHH3蛋白均主要定位于細胞核，細胞核棕黃色染色為CDC7和PHH3表達陽性，其表達水平以陽性細胞數計算，即200倍顯微鏡下計數10個視野中陽性細胞數占總細胞數的百分比，＜10%判定為陰性，≥10%判定為陽性。所有組織標本均由2名病理醫師獨立進行評定。

1.5 統計學方法

采用SPSS 13.0軟件對數據進行統計分析。計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法；相關性分析采用Spearman相關分析；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CDC7和PHH3蛋白的陽性表達情況

正常宮頸組織中未見CDC7和PHH3蛋白陽性表達；CINI～Ⅲ組織中，CDC7和PHH3蛋白陽性表達，陽性細胞數逐漸增多；宮頸腺癌和宮頸鱗癌組織中，CDC7和PHH3蛋白陽性表達細胞數明顯增多且染色逐漸加深。（圖1、圖2）

2.2 CDC7和PHH3蛋白陽性表達率的比較

病理學檢測結果中，CDC7和PHH3蛋白在正常宮頸組織、CINI級、CINⅡ～Ⅲ級、宮頸腺癌和宮頸鱗癌中的陽性表達率明顯升高，組間比較差異均有統計學意義（χ2=61.509，P＜0.01；χ2=54.966，P＜0.01）。在宮頸脫落細胞學檢查結果中，CDC7和PHH3蛋白在正常宮頸組織、ASCUS、LSIL、ASC-H和HSIL中的陽性表達率明顯升高，組間比較差異均有統計學意義（χ2=50.406，P＜0.01；χ2=54.761，P＜0.01）。（表1）

2.3 不同臨床特征宮頸癌組織中CDC7和PHH3蛋白的陽性表達情況

不同臨床分期的宮頸癌患者的CDC7蛋白陽性表達率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；不同年齡、淋巴結轉移情況、病理分型和病理分級的宮頸癌患者CDC7蛋白陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。不同淋巴結轉移情況和臨床分期的宮頸癌患者PHH3蛋白陽性表達率比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；不同年齡、病理分型及病理分級的宮頸癌患者的PHH3蛋白陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表 2）

2.4 不同程度宮頸病變組織中CDC7和PHH3蛋白陽性表達的相關性分析

Spearman相關分析結果顯示，CDC7陽性表達與PHH3陽性表達呈明顯正相關（r=0.390，P＜0.01）。

圖1 正常宮頸組織及不同程度宮頸病變組織中CDC7蛋白的表達情況（免疫組織化學染色，×200）

圖2 正常宮頸組織及不同程度宮頸病變組織中PHH3蛋白的表達情況（免疫組織化學染色，×200）

表1 144例宮頸疾病患者的宮頸組織中CDC7和PHH3蛋白陽性表達情況

表2 不同臨床特征宮頸癌組織中CDC7和PHH3蛋白的表達情況（n=54）

3 討論

細胞分子生物學研究認為，腫瘤的發生本質上是由于細胞周期的調控紊亂導致，與參與DNA復制的相關蛋白密切相關[3]。檢測影響細胞周期調控的生物標志物，可以預測腫瘤的發生發展。

CDC7蛋白是參與DNA復制的重要蛋白之一。CDC7蛋白在細胞有絲分裂進入S期時發揮重要作用，且該蛋白的表達在整個細胞周期中相對恒定，但其活性會隨細胞周期的變化而改變。RNA 干擾（RNA interference，RNAi）沉默CDC7的表達，可導致腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞的增殖。Rodriguez-Acebes等[5]對乳腺癌進行了重點研究，結果發現，CDC7蛋白高表達可導致細胞周期進展加速、腫瘤細胞分化阻滯、基因組不穩定等，表明CDC7蛋白的異常表達與腫瘤的發生發展相關。因此，可采用CDC7蛋白作為生物學標志物，評估腫瘤細胞的增殖狀態，CDC7蛋白可能具有作為一類新的抗腫瘤藥物模型的潛能。

研究顯示，CDC7和PHH3蛋白在部分腫瘤中的表達具有相關性[6]。PHH3蛋白可協助評估子宮內膜癌的病理分級，并可作為核分裂的標志物，定量分析細胞的增殖情況[7]。PHH3蛋白定位于細胞有絲分裂早期的細胞核，能明確反映正常、凋亡和退變的細胞核，提高辨認細胞核分裂的靈敏度及特異度。PHH3蛋白高表達可以促進細胞增殖和腫瘤生長，因此，檢測PHH3蛋白在腫瘤細胞中的表達情況，可降低細胞學檢測中的假陰性率，并可鑒別ASC-H和HSIL的患者。目前，ASC-H一般采用陰道鏡活檢確診，部分臨床醫師建議保守治療，定期復查，有可能延誤了最佳治療時間。

臨床上可采用宮頸脫落細胞學檢查CDC7和PHH3蛋白的陽性表達情況，進行早期篩查宮頸癌，做到早發現、早治療。細胞分子生物學研究認為，腫瘤發生的本質上是由于細胞周期的調控紊亂，呈現出過度增殖和凋亡不足的狀態。隨著對細胞周期調控研究的不斷深入，多數學者認同了腫瘤的發生多與細胞周期調控有關的觀點[8]。本研究結果顯示，CDC7和PHH3蛋白的陽性表達率均隨宮頸病變的嚴重程度而逐漸升高，表明CDC7和PHH3蛋白的表達情況可能與宮頸癌的發生發展有關。

CDC7和PHH3蛋白均可促進腫瘤細胞的增殖，CDC7是絲氨酸/蘇氨酸激酶，反映細胞周期中的S期，可調控微小染色體維持蛋白（minichromosome maintenance protein，MCM）的N端氨基酸磷酸化，磷酸化后的MCM可失活，并結合于染色質上的轉錄起始位點，啟動DNA復制過程，通過調控細胞周期促進腫瘤細胞增殖[9]。由于CDC7在所有轉移腫瘤細胞中均高表達，使其成為目前關于腫瘤研究的重要標志物和靶點[10]。目前，國內外的相關研究多集中于CDC7和PHH3蛋白在乳腺癌、前列腺癌、食管癌、胃癌、肝癌和非小細胞肺癌等惡性腫瘤中的表達，且已經發現其與臨床療效及預后有一定關系。雖然，徐瑞云等[11]采用實時逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測子宮內膜腺癌組織中CDC7mRNA的表達水平，結果顯示，子宮內膜癌組織中CDC7mRNA的表達水平明顯高于正常子宮內膜組織（P＜0.05）。但對于宮頸病變組織中CDC7和PHH3蛋白促進腫瘤發展的作用機制及其與臨床特征的關系尚未明確。此外，部分宮頸病變的病理學診斷及鑒別非常困難，主要原因包括以下3個方面：①絕經后女性的鱗狀上皮萎縮及CIN病變，尤其是高度的CIN病變；②宮頸腺體的鱗化及化生性增生與CIN病變；③嚴重的宮頸炎可能刺激上皮反應性增生或掩蓋高度的CIN。因此，尋找更為準確的標志物量化、輔助病理學診斷，提高其診斷的準確度至關重要。

本研究結果顯示，CDC7蛋白的陽性表達可能與宮頸癌臨床分期有關，與年齡、淋巴結轉移、病理分型和病理分級無關；PHH3蛋白的陽性表達可能僅與宮頸癌淋巴結轉移有關。表明CDC7和PHH3蛋白可能與宮頸癌的浸潤、轉移和預后有關，有望成為評估宮頸癌臨床進展及預后的指標。但本研究僅納入了10例宮頸腺癌患者，結果可能存在偏差，需進一步擴大樣本量深入研究。

綜上所述，CDC7和PHH3蛋白的高表達與宮頸癌的發生、發展、侵襲和轉移有關，有望成為評估、預測宮頸癌侵襲轉移的指標。