寧動顆粒對多巴胺能神經元代謝的影響

李夢盈 姜莉苑 孫克興

[摘要] 目的 研究寧動顆粒對多巴胺能神經元細胞代謝的影響。 方法 將12只18 d胎齡胎鼠隨機分為寧動顆粒組（NDG）、對照組（CTR）、氟哌啶醇組（Hal）、正常組（Normal），每組3只。將每組的多巴胺能神經細胞分別提取分離并培養，采用免疫熒光間接法對多巴胺能神經元細胞進行酪氨酸羥化酶（TH）抗染色;采用神經元軸突微管蛋白anti-Tau1結合FITC熒光（綠光）Ⅱ抗標記、神經元軸突微管蛋白anti-Tau1結合Cy 3熒光（紅光）Ⅱ抗標記，分別對多巴胺能神經元細胞及神經元軸突進行熒光染色鑒定，采用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測18 d胎齡胎鼠DA能神經細胞在藥物干預前及干預1、6、12、24 h后多巴胺能神經元細胞培養液中單胺氧化酶（MAO）、DA、5-羥色胺（5-HT）、高香草酸（HVA）、5-羥吲哚乙酸（5-HIAA）含量，并記錄各組DA能神經元細胞的代謝情況。 結果 與同組0 h比較，NDG組干預6、12 h后細胞培養液中MAO、DA、5-HT、HVA含量顯著升高（P < 0.05）;與CTR組同期比較，Hal組干預0～24 h后細胞培養液中MAO、DA、5-HT、HVA含量差異無統計學意義（P > 0.05）;干預0～24 h后，各組胎鼠培養液中5-HIAA含量差異無統計學意義（P > 0.05）。 結論 寧動顆粒能促進多巴胺能神經元代謝，但對5-HT的代謝無顯著性影響。

[關鍵詞] 寧動顆粒;多巴胺能神經元;5-羥色胺;遞質代謝

[中圖分類號] R285.5? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）01（a）-0004-04

抽動-穢語綜合征（Tourette′s syndrome，TS）是一種以無意識且重復、無目的的刻板行為為特征的慢性神經精神性疾病，臨床表現主要以頭腹部及四肢不自主抽動且喉部發出奇特叫聲為特征[1]。TS屬于中醫“抽搐”“驚風”“筋惕肉瞤”范疇[2-5]，其癥狀經常反復、交替出現，時而重、時而輕，且病程較長，部分患者癥狀會持續到18歲以后，甚至有少數患者持續一生，嚴重影響患者的正常生活[6]。

TS病因及發病機制至今尚未完全明確[7]。目前認為TS發病與單胺類神經遞質代謝失衡關系最密切[8-11]。單胺類神經遞質主要包括多巴胺（DA）和5-羥色胺（5-HT）。

寧動顆粒是名中醫李安源教授的經驗方[12-13]。寧動顆粒能有效抑制TS模型大鼠抽動等刻板行為，同時改善多動及學習、記憶能力，其作用機制與抑制DA系統興奮性密切相關[14-15]。本研究擬探討寧動顆粒對體外多巴胺能神經元細胞的代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試藥? 寧動顆粒（NDG，深圳三九中藥有限公司，批號：201603212）;氟哌啶醇（Hal，2 mg/片，上海安心八福藥業有限公司，批號：H86749384）;阿樸嗎啡（Apo，美國Sigma公司）;胰酶細胞消化液（100 ml/瓶，美國HyClone公司）;PBS緩沖液（10×，美國HydoneLaboraories公司）;胎牛血清（含雙抗，500 ml/瓶，美國Gibco公司）;DMEM培養基（Hyclone 31600-034，美國）;DAPI染色液、兔抗色氨酸羥化酶、神經元軸突微管蛋白Anti-Tau1、羊抗兔熒光Ⅱ抗IgG/FITC、羊抗兔IgG/Cy 3均由美國Abcam公司生產;DA、5-HT、單胺氧化酶（MAO）、高香草酸（HVA）、5-羥吲哚乙酸（5-HIAA）、酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測試劑盒（美國DB公司）。

1.1.2 動物? 12只18 d孕齡的Wistar大鼠由上海兒童醫學中心動物實驗中心提供，SPF級，合格證號：11401500007810，體重（312.6±12.3）g，動物房室溫（23±2）℃，相對濕度45%～65%，采用12 h光照黑暗自動循環。

1.2 方法

1.2.1 新生大鼠多巴胺能神經元及膠質細胞的分離培養[16]? 取18 d孕齡的Wistar大鼠，脫頸處死，浸入75%的酒精消毒后，縱向剪開大鼠腹部，用無菌鑷子取出子宮，剪開胎盤及羊膜囊，取出腹中胎鼠，將所有胎鼠的頭部剪下并剖開顱骨，取出額葉前回，移到含20%葡萄糖和80%HBSS的EP管中。用0.25%胰蛋白酶孵育神經組織30 min，再加入接種液，停止消化，將胰蛋白酶液洗去，用細口吸管將細胞懸液打碎，多次反復操作，將沉淀后的上層細胞懸液吸出，并計數預置細胞的密度，接種在25 cm2培養瓶，再置于配好的培養液中培養，于細胞培養箱中孵育。培養液配制如下：DMEM（含葡萄糖600 mg/100 mL、NaHCO3 3.7 g/L），10%胎牛血清20 ng/mL，神經營養素1 mL/100 mL，谷氨酰胺100 μg/mL。

1.2.2 細胞鑒定? 放入培養箱中培養2 d后，取出蓋玻片，采用免疫熒光間接法對多巴胺能神經元細胞進行酪氨酸羥化酶（TH）抗染色;采用神經元軸突微管蛋白anti-Tau1結合FITC熒光（綠光）Ⅱ抗標記、神經元軸突微管蛋白anti-Tau1結合Cy 3熒光（紅光）Ⅱ抗標記，激光掃描共聚焦熒光顯微鏡下成像。

1.2.3 DA、HVA、5-HT、5-HIAA、MAO濃度測定? 將上述分離的神經元細胞置于培養瓶中，24 h后種植于24孔培養板，再將培養板置于37°C、5%CO2條件下，經24 h后換液，放回培養箱繼續孵育24 h后再換液。將培養板隨機等量分為寧動顆粒（NDG）組、對照（CTR）組、氟哌啶醇（Hal）組、正常（Normal）組，各組分別加15 μg/μL的NDG、Hal、Apo、生理鹽水后，在加藥干預1、6、12、24 h后，取各培養液上清液，采用ELISA法檢測細胞上清液中DA、HVA、5-HT、5-HIAA、MAO的含量。

1.2.4 統計學方法? 采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用q或t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞鑒定

放入培養箱中培養2 d后，取出蓋玻片，采用免疫熒光間接法對多巴胺能神經元細胞進行TH抗染色;采用神經元軸突微管蛋白anti-Tau1結合FITC熒光（綠光）Ⅱ抗標記、神經元軸突微管蛋白anti-Tau1結合Cy 3熒光（紅光）Ⅱ抗標記，激光掃描共聚焦熒光顯微鏡下成像。見圖1（封四）。

2.2 組間細胞培養液中MAO、DA、5-HT、HVA、5-HIAA含量比較

Normal組、CTR組及Hal組多巴胺能神經元細胞培養液中的MAO、DA、5-HT、5-HIAA含量在干預0～24 h后，差異無統計學意義（P > 0.05）。與同組0 h比較，NDG組胎鼠的細胞培養液干預6、12、24 h后的DA含量降低，而5-HT及MAO含量在干預6、12 h后升高，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。見表1、圖2～3。

Hal組在藥物干預24 h內HVA含量無明顯變化（P > 0.05）;與0 h比較，NDG組HVA含量在藥物干預6、12、24 h時顯著性升高（P < 0.01）。見表1。

3 討論

TS治療目前主要依靠西藥，其中氟哌啶醇、硫必利等精神類藥物已成為治療TS的一線藥物，西藥能抑制患兒大腦皮質運動區的興奮性，減輕抽動癥狀[17-19]。氟哌啶醇服用后產生的帕金森樣震顫、嗜睡、強迫性張口、反復徘徊、伸舌等不良反應與藥物干預劑量、時間有著密切的關系，這些不良反應使患兒及其家長無法接受和繼續治療[20-21]。

單胺類神經遞質主要包括DA、5-HT，其中DA的神經傳遞異常在TS病理生理學中發揮主要作用。MAO是催化單胺氧化脫氨反應的酶，DA、5-HT在腦內MAO作用下分別降解為HVA、5-HIAA排出體外[22-23]。

Apo的誘導增強了黑質-紋狀體DA系統功能[14]，從而誘導并增強了大鼠的刻板行為，故Apo可誘導大鼠出現TS的抽動刻板行為。NDG能對DA能系統代謝產生促進作用，但多巴胺能神經元系統體外實驗研究尚未得到證實[15，24]。

本研究結果顯示，NDG組MAO含量在6、12 h酶的活性最高（圖2）;其細胞培養血清中DA含量在6、12 h明顯降低，在24 h時上升，且HVA含量在6、12 h顯著升高，在24 h時降低，提示NDG能促進MAO的活性升高，進而促進DA的代謝，使DA的代謝產物HVA含量升高。

NDG組5-HT的含量在6、12 h顯著升高，在24 h有所下降，而代謝產物5-HIAA含量卻無顯著變化，提示NDG能促進5-HT釋放，但是對5-HT代謝的影響不大。

綜上所述，MAO活性在NDG干預后6～12 h最強，DA含量在干預后12 h最低，HVA在干預后12 h含量最高，提示DA在寧動顆粒干預后6～12 h代謝最為旺盛。NDG能有效促進DA能神經元代謝，能有效調控DA代謝，但對5-HT系統代謝影響不大。

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（收稿日期：2018-07-16? 本文編輯：王? ?蕾）