三花龍膽化學成分及抗腫瘤活性研究

周艷麗 王大利 張艷 張寧 李碩熙 吳嬌

[摘要] 目的 探討三花龍膽（Gentiana triflora Pall.）的化學成分及其體外抗腫瘤活性。 方法 采用95%乙醇對三花龍膽根莖進行回流提取，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取，萃取物用硅膠柱色譜、制備型高效液相色譜進行分離純化，根據(jù)理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)對化合物進行結(jié)構(gòu)鑒定;采用四氮唑鹽還原法（MTT）評價各化合物的抗腫瘤活性。 結(jié)果 從乙酸乙酯和正丁醇萃取部位分離得到5個化合物，分別鑒定為globuloside A（1）、cornusoside A（2）、cornolactone A（3）、6，9-epi-8-O-Acetylshanziside methyl ester（4）、5，9-epi-Penstemoside（5）;抗腫瘤活性實驗表明，化合物1對HepG2細胞的體外增殖具有一定的抑制作用，IC50值為6.7 μmol/L。 結(jié)論 所有化合物均首次從該植物中分離得到;化合物1對HepG2細胞的增殖具有明顯的抑制活性。

[關(guān)鍵詞] 三花龍膽;化學成分;結(jié)構(gòu)鑒定;抗腫瘤活性

[中圖分類號] R284.1? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）01（a）-0020-04

三花龍膽（Gentiana triflora Pall.）為龍膽科（Gentianaceae）龍膽屬（Gentiana）多年生草本植物，喜陰，耐寒;主要分布于中國東北、華北，以及日本、朝鮮、俄羅斯東部等地，具有較高的觀賞價值和藥用價值，在民間多用于清濕熱、瀉肝火[1]。龍膽屬植物主要含有環(huán)烯醚萜、裂環(huán)環(huán)烯醚萜及其苷類化合物[2-16]。然而，國內(nèi)外關(guān)于常用藥材的三花龍膽的化學成分及生物活性的研究報道較少。有文獻[17]報道，龍膽屬植物具有抗腫瘤活性，但發(fā)現(xiàn)的活性成分很少。為明確三花龍膽的化學成分、探討其抗腫瘤藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究對三花龍膽的化學成分及體外抗腫瘤活性進行研究，以期為確定三花龍膽的抗腫瘤藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Mercury Plus 400 MHz核磁共振儀（美國Varian公司）;Agilent 1260高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）;LC-20AR制備型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）;YMC ODS-A制備色譜柱（250 mm×10 mm，5 μm，日本YMC公司）;RV 10 digital V旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國IKA公司）;柱色譜硅膠（300～400目，青島海洋化工廠）。Multiskan GO 酶標儀（美國Thermo-Fisher公司）;TS-100F倒置顯微鏡（日本Nikon公司）;MCO-20AIC CO2培養(yǎng)箱（日本SANYO公司）;SW-CJ-2FD超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）;TGL-16M臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）。

1.2 試藥

實驗所用試劑為分析純和色譜純（天津市科密歐化學試劑有限公司）。

實驗用三花龍膽于2015年8月購買于河北省安國市，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學佳木斯學院陳效忠副教授鑒定為龍膽屬（Gentiana）植物三花龍膽（Gentiana triflora Pall.）的全草。藥材標本保存于黑龍江中醫(yī)藥大學佳木斯學院標本館。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取與分離方法

稱取三花龍膽干燥全草5 kg粉碎，用體積分數(shù)為95%的乙醇加熱回流提取3次，合并提取液，經(jīng)減壓濃縮得到浸膏425 g，加40℃去離子水均勻分散，之后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，濃縮萃取液，得到石油醚萃取物28 g、乙酸乙酯萃取物35 g、正丁醇萃取物77 g。乙酸乙酯萃取物經(jīng)硅膠柱色譜分離，用二氯甲烷-甲醇溶劑系統(tǒng)（50∶1→5∶1）梯度洗脫，分段為5個部分（Fr1～Fr5），其中Fr1（6 g）經(jīng)硅膠柱色譜分離，用二氯甲烷-甲醇溶劑系統(tǒng)（100∶1→5∶1）梯度洗脫，得化合物2（12 mg），化合物3（7 mg）;正丁醇萃取物經(jīng)硅膠柱色譜分離，用二氯甲烷-甲醇溶劑系統(tǒng)（50∶1→1∶1）梯度洗脫，分段為6個部分（Fr1～Fr6），其中Fr1（13 g）經(jīng)硅膠柱色譜分離，用二氯甲烷-甲醇溶劑系統(tǒng)（100∶1→1∶1）梯度洗脫，分為8個流分（Fr.1-1～Fr.1-8）。Fr.1-1（1.5 g）經(jīng)制備型高效液相色譜分離，用45%甲醇-水等度洗脫，得到化合物1（9 mg）、化合物4（13 mg）;Fr.1-2（2.1 g）經(jīng)制備型高效液相色譜分離，用30%甲醇-水等度洗脫，得化合物5（15 mg）。

2.2 體外抗腫瘤活性實驗方法

采用四氮唑鹽還原法（MTT比色法）分別評價5個化合物對三種腫瘤細胞（人肝癌細胞HepG2、BeL7402和小鼠肝癌細胞H22）的抑制作用。腫瘤細胞使用DMEM（含10%胎牛血清、1%雙抗）培養(yǎng)基在含5%CO2的孵箱中于37℃條件下培養(yǎng)。首先，在96孔培養(yǎng)板的每個孔中接種100 μL處于對數(shù)生長期的腫瘤細胞（個數(shù)約為1×104），培養(yǎng)12 h后加入梯度濃度的受試藥物，每個劑量設5個復孔，同時設空白對照孔、調(diào)零孔，在37℃，5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h。然后，每孔加入20 μL的5 g/L的MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h。最后，離心棄去培養(yǎng)液，每空加入150 μL的二甲基亞砜（DMSO），振蕩10 min，待結(jié)晶充分溶解后，用酶標儀于570 nm處測定各孔的吸光度（OD值）。

2.3 化學成分鑒定

化合物1：白色粉末。化合物為a和b兩部分構(gòu)成的二聚體。a部分：1H NMR （CDCl3，400 MHz）δ：5.06（1H，dd，J = 6.0，1.8 Hz，H-3），5.08（1H，dd，J = 6.0， 4.7 Hz，H-4），2.29（1H，m，H-5），3.92（1H，brs，H-6），3.51（1H，brs，H-7），2.59（1H，dd，J = 9.7，7.6 Hz，H-9），4.98（1H，d，J = 12.5 Hz，H-10a），4.23（1H，d，J = 12.5Hz，H-10b），5.01（1H，d，J = 8.1 Hz，H-1′），4.79（1H，dd，J = 8.1，9.5 Hz，H-2′），3.55（1H，t，J = 9.5 Hz，H-3′），3.38（1H，m，H-4′），3.39（1H，m，H-5′），3.96（1H，brd，J = 12.0 Hz，H-6a′），3.70（1H，dd，J = 12.0，5.5 Hz，H-6b′），7.66（1H，m，H-2′′），7.42（1H，m，H-3′′），7.42（1H，m，H-4′′），7.42（1H，m，H-5′′），7.66（1H，m，H-6′′），7.71（1H，d，J = 16.0 Hz，H-a），6.59（1H，d，J = 16.0 Hz，H-b）;b部分：1H NMR（CDCl3，400 MHz）δ：6.38（1H，s，H-1），7.41（1H，d，J =1.8 Hz，H-3），3.61（1H，m，H-5），2.57（1H，m，H-6a），1.46（1H，m，H-6b），2.52（1H，m，H-7），4.29（1H，brd，J = 12.5 Hz，H-10a），4.20（1H，dd，J = 12.5，1.0 Hz，H-10b），4.70（1H，d，J = 7.9 Hz，H-1′），3.17（1H，dd，J = 7.9，9.0 Hz，H-2′），3.40（1H，m，H-3′），3.30（1H，m，H-4′），3.32（1H，m，H-5′），3.88（1H，m，H-6a′），3.69（1H，m，H-6b′）。以上數(shù)據(jù)與文獻[18]報道的化合物基本一致，故鑒定化合物為globulosideA（圖1）。

化合物2：白色粉末。1H NMR （CDCl3，400 MHz）δ：3.99（1H，dd，J = 10.4，3.6 Hz，H-1a），3.39（1H，m，H-1b），3.96（1H，d，J = 5.6 Hz，H-4），3.38（1H，q，J = 7.2 Hz，H-5），5.05（1H，t，H-6），2.01（1H，dd，J = 13.6， 6.0 Hz，H-7a），1.49（1H，ddd，J = 13.6，11.6，6.0 Hz，H-7b），1.91（1H，m，H-8），1.85（1H，m，H-9），0.96（3H，d，J = 5.6 Hz，H-10），3.70（3H，s，OMe），4.07（1H，d，J = 7.8 Hz，H-1′），2.94（1H，td，J = 8.0，4.4 Hz，H-2′），3.12（1H，m，H-3′），3.05（1H，m，H-4′），3.08（1H，d，J = 3.9 Hz，H-5′），3.65（1H，m，H-6a′），3.45（1H，m，H-6b′），4.74（1H，d，J = 4.3 Hz，OH-2′），4.95（1H，d，J = 5.0 Hz，OH-3′），4.94（1H，d，J = 5.5 Hz，OH-4′），4.47（1H，t，J = 5.9 Hz，OH-6′）。以上數(shù)據(jù)與文獻[19]報道的化合物基本一致，故鑒定化合物為cornusoside A（圖2）。

化合物3：白色粉末。1H NMR（CDCl3，400 MHz） δ：3.88（1H，dd，J = 11.0，4.0 Hz，H-1a），3.59（1H，dd，J = 11.0，9.0 Hz，H-1b），2.68（1H，dd，J = 18.8，4.7 Hz，H-4a），2.61（1H，dd，J = 18.8，9.8 Hz，H-4b），3.15（1H，m，H-5），5.02（1H，t，J = 6.0 Hz，H-6），2.22（1H，dd，J = 14.0，5.0 Hz，H-7a），1.45（1H，ddd，J = 14.0，11.8，5.5 Hz，H-7b），1.83（1H，m，H-8），1.81（1H，m，H-9），1.03（3H，d，J = 5.6 Hz，H-10）。以上數(shù)據(jù)與文獻[19]報道的化合物基本一致，故鑒定化合物為cornolactone A（圖3）。

化合物4：白色粉末。1H NMR（CDCl3，400 MHz） δ：5.92（1H，d，J = 2.5 Hz，H-1），7.46（1H，d，J = 1.5 Hz，H-3），3.08（1H，dd，J = 1.5，9.0 Hz，H-5），4.35（1H，m，H-6），2.21（1H，brd，H-7a），2.05（1H，brd，H-7b），3.01（1H，dd，J = 2.5，9.0 Hz，H-9），1.53（1H，s，H-10），3.74（3H，s，OMe-11），2.03（1H，s，OCOCH3-8），4.65（1H，d，J = 8.0 Hz，H-1′），3.18（1H，dd，J = 8.0，9.0 Hz，H-2′），3.38（1H，t，J = 9.0 Hz，H-3′），3.28（1H，t，J = 9.0 Hz，H-4′），3.31（1H，m，H-5′），3.91（1H，dd，J = 2.0，12.0 Hz，H-6a′），3.68（1H，dd，J = 6.0，12.0 Hz，H-6b′）。以上數(shù)據(jù)與文獻[19]報道的化合物基本一致，故鑒定化合物為6，9-epi-8-O-Acetylshanziside methyl ester（圖4）。

化合物5：白色粉末。1H NMR（CDCl3，400 MHz） δ：5.83（1H，s，H-1），7.57（1H，s，H-3），4.30（1H，t，J = 4.5 Hz，H-6），1.49（1H，ddd，J = 5.0，6.5，11.5 Hz，H-7a），1.82（1H，ddd，J = 4.5，7.0，11.5 Hz，H-7b），2.63（1H，s，H-8），2.59（1H，m，H-9），0.95（1H，d，J = 7.0 Hz，H-10），3.75（3H，s，OMe-11），4.59（1H，d，J = 8.0 Hz，H-1′），3.20（1H，dd，J = 8.0，9.0 Hz，H-2′），3.39（1H，t，J = 9.0 Hz，H-3′），3.26（1H，t，J = 9.0 Hz，H-4′），3.32（1H，m，H-5′），3.93（1H，dd，J = 2.0，12.0 Hz，H-6a′），3.67（1H，dd，J = 6.0，12.0 Hz，H-6b′）。以上數(shù)據(jù)與文獻[20]報道的化合物基本一致，故鑒定化合物為5，9-epi-Penstemoside（圖5）。

2.4 抗腫瘤活性

藥理活性測試發(fā)現(xiàn)，化合物1對HepG2的增殖具有明顯的抑制作用，IC50值為6.7 μmol/L，且在測定濃度范圍內(nèi)劑量依賴性較好;其他化合物均無顯著的抗腫瘤活性（化合物2～4的IC50值分別為38.6、22.5、30.7 μmol/L）。

3 討論

三花龍膽是一種常用藥用植物資源，應用范圍廣，療效確切，但關(guān)于其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究很少。本研究對該植物進行了系統(tǒng)的化學成分分析，首次從該植物中獲得5個環(huán)烯醚萜類化合物，其中一個化合物具有良好的抗腫瘤活性，為闡明三花龍膽的抗腫瘤作用奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。繼續(xù)研究該植物的化學成分，并分析活性化合物的作用機制，以期為該藥用資源更好地應用奠定基礎(chǔ)。

[參考文獻]

[1]? 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].一部.北京：化學工業(yè)出版社，2005，64.

[2]? Wang S，Xu Y，Jiang W，et al. Isolation and identification of constituents with activity of inhibiting nitric oxide production in RAW 264.7 macrophages from Gentiana triflora [J]. Planta Med，2013，79（8）：680-686.

[3]? Koshioka M，Miyamoto K，Horio T，et al. Identification of endogenous gibberellins in stems and leaves in vegetative growth stage of Gentiana triflora [J]. J Plant Physiol，1998， 153（1/2）：230-232.

[4]? Suyama Y，Tanaka N，Kawazoe K，et al. Rigenolides D-H，norsecoiridoid and secoiridoids from Gentiana rigescens Franch [J]. J Nat Med，2018，72（2）：1-6.

[5]? Yang Y，Wang Z，Zhang L，et al. Protective effect of gentiopicroside from Gentiana macrophylla Pall. in ethanol-induced gastric mucosal injury in mice [J]. Phytother Res，2017，32（2）：259-266.

[6]? Xu Y，Li Y，Maffucci KG，et al. Analytical methods of phytochemicals from the genus Gentiana [J]. Molecules，2017，22（12）：2080.

[7]? Chen B，Peng Y，Wang X，et al. preparative separation and purification of four glycosides from Gentianae radix by high-speed counter-current chromatography and comparison of their anti-NO production effects [J]. Molecules，2017，22（11）：2002.

[8]? Ghazanfar K，Mubashir K，Dar SA，et al. Gentiana kurroo Royle attenuates the metabolic aberrations in diabetic rats;Swertiamarin，swertisin and lupeol being the possible bioactive principles [J]. J Complement Integr Med，2017， 14（3）：27.

[9]? Zou YF，F(xiàn)u YP，Chen XF，et al. Polysaccharides with immunomodulating activity from roots of Gentiana crassicaulis [J]. Carbohydr Polym，2017，172：306-314.

[10]? Cao X，Guo X，Yang X，et al. Transcriptional Responses and Gentiopicroside Biosynthesis in Methyl Jasmonate-Treated Gentiana macrophylla Seedlings [J]. PLloS One，2016，11（11）：e0 166 493.

[11]? Pan Y，Zhao YL，Zhang J，et al. Phytochemistry and Pharmacological Activities of the Genus Gentiana （Gentianaceae）[J]. Chem. Biodivers， 2016，47（16）：107.

[12]? Waltenberger B，Liu R，Atanasov AG，et al. Nonprenylated Xanthones from Gentiana lutea，F(xiàn)rasera caroliniensis，and Centaurium erythraea as Novel Inhibitors of Vascular Smooth Muscle Cell Proliferation [J]. Molecules，2015，20（11）：20 381.

[13]? Wang Z，Wang C，Su T，et al. Antioxidant and immunological activities of polysaccharides from Gentiana scabra Bunge roots [J]. Carbohydr Polym，2014，112（112）：114-118.

[14]? Wang S，Xu Y，Chen P，et al. Structural characterization of secoiridoid glycosides by high-performance liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry [J]. Rapid Commun Mass Spectrom，2014，28（14）：1569-79.

[15]? Xu M，Wang D，Zhang YJ，et al. Iridoidal glucosides from Gentiana rhodantha [J]. J Asian Nat Prod Res，2008，10（6）：491-498.

[16]? 徐毅敏.三花龍膽化學成分及其抗炎活性研究[D].杭州：浙江大學，2013.

[17]? Yang AM，Sun J，Li H，et al. Chemical Constituents and Anti-Tumor Activity of Gentiana farreri [J]. Advan Mat Res，2012，554-556：1682-1685.

[18]? Cali■ I，Kirmizibekmez H，Sticher O. Iridoid glycosides from Globularia trichosantha [J]. J Nat Prod，2001，64（1）：60-64.

[19]? He Y，Peng J，Hamann M T，et al. An iridoid glucoside and the related aglycones from Cornus florida [J]. J Nat Prod，2014，77（9）：2138-43.

[20]? Delazar A，Byres M，Gibbons S，et al. Iridoid Glycosides from Eremostachys glabra [J]. J Nat Prod，2004，67（9）：1584-1587.

（收稿日期：2018-05-28? 本文編輯：王? ?蕾）