肺結核患者T輔助細胞、NKT細胞、NK細胞水平與疾病發展及預后的關系

李利娟

[摘要] 目的 研究肺結核患者T輔助細胞、自然殺傷T細胞（NKT細胞）、自然殺傷細胞（NK細胞）水平與疾病發展及預后的關系。 方法 選取2015年12月～2016年12月四川大學華西廣安醫院（以下簡稱“我院”）收治的肺結核病患者100例，選取同期我院體檢的健康者100例;根據初診、復診、結核菌素情況將其分為四組（Ⅰ～Ⅳ組分別為初診肺結核組、復診肺結核組、結合菌素陽性健康組、結合菌素陰性健康組）。使用流式細胞儀檢測四組治療前外周血T細胞、NKT、NK細胞表達率。 結果 與Ⅲ組比較，Ⅰ組患者NKT細胞表達率顯著升高，差異有統計學意義（P < 0.05），兩組T細胞及NK細胞表達率差異無統計學意義（P > 0.05）;與Ⅳ組比較，Ⅰ組患者NKT細胞表達率顯著升高，差異有統計學意義（P < 0.05），兩組T細胞及NK細胞表達率差異無統計學意義（P > 0.05）;與Ⅰ組比較，Ⅱ組患者T細胞表達率顯著升高，差異有統計學意義（P < 0.05），但兩組NKT細胞及NK 細胞表達率差異無統計學意義（P > 0.05）;Ⅲ組及Ⅳ組在T細胞、NK、NKT細胞表達率差異無統計學意義（P > 0.05）。Ⅰ組患者中輕癥、中癥及重癥亞組T細胞表達率差異有統計學意義（P < 0.05），表達率：重癥>中癥>中輕癥。三個亞組的NKT細胞及NK細胞表達率差異無統計學意義（P > 0.05）。100例肺結核患者治療后均隨訪6個月，2例痰菌復陽，1例病灶惡化，其余均未復發。 結論 初診患者T細胞表達水平與健康者相當，與疾病嚴重程度相關。復診患者T細胞表達率明顯升高。活動性結核患者中NKT細胞表達增加。因此，NK、T細胞測定可輔助診斷活動性結核。

[關鍵詞] 肺結核;T輔助細胞;NKT細胞;NK細胞;預后

[中圖分類號] R521? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）01（a）-0098-04

當結核分枝桿菌侵入人體時，可激活人體先天性及適應性免疫防御反應，反應強度與癥狀呈正相關[1]。一些患者感染結核分枝桿菌后立即變為活動性結核病，但大多數患者體內感染結核菌會處于終身潛伏感染狀態[2]。自然殺傷細胞（NK細胞）主要參與先天性免疫，T輔助細胞主要參與適應性免疫，自然殺傷T細胞（NKT細胞）為新型的免疫細胞，主要特征為CD3和CD56雙陽[3]。NKT細胞具有NK細胞及T細胞的雙重表型功能，可作為先天性和適應性免疫反應的連接紐帶[4]。其作用靶點為結核分枝桿菌胞壁的磷酯酰肌醇甘露糖，當NKT細胞被激活后，可分泌γ干擾素（INF-γ），抑制結核菌正常活動，并分泌具有殺傷作用的顆粒素[5]。肺結核患者免疫作用復雜，本研究探討了肺結核患者T輔助細胞、NKT細胞及NK細胞的表達，旨在分析上述細胞對結核病診治及預后的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年12月～2016年12月四川大學華西廣安醫院（以下簡稱“我院”）收治的肺結核病患者100例，包括61例初診患者和39例復診患者。所有患者均符合《臨床診療手冊（結核病分冊）》[6]的診斷標準。經痰抗酸桿菌涂片檢驗確診為肺結核，且人類免疫缺陷病毒（HIV）呈陰性。其中男73例，女27例;年齡17～70歲，平均（41.6±6.7）歲。另選取同期我院體檢且X線胸片未見異常的健康者100例。其中56例結核菌素皮試陽性，44例陰性。根據初診、復診、結核菌素情況將其分為四組，各組的基本資料：①初診肺結核組（Ⅰ組）：共61例，其中男42例，女19例;年齡19～68歲，平均（40.2±5.5）歲。根據患者的肺部病變、空洞、發熱等癥狀，由2位醫生根據《結核病的診斷標準和分類（續1）臨床與X線表現》[7]將患者分為輕癥、中癥及重癥亞組，分別有15、22、24例。②復診肺結核組（Ⅱ組）：共39例，其中男31例， 女8例;年齡23～71歲，平均（42.6±6.0）歲。③結核菌素陽性健康組（Ⅲ組）：共56例，其中男21例，女35例;年齡21～67歲，平均（34.7±5.1）歲。④結核菌素陰性健康組（Ⅳ組）：共44例，其中男16例，女28例;年齡20～67歲，平均（38.9±6.4）歲。四組在治療前的一般資料比較，差異無統計學意義（P > 0.05），具有可比性。本研究經我院醫學倫理委員會批準，所有入選者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 納入及排除標準

1.2.1 納入標準? ①符合結核病診斷標準，經檢測證實為肺結核;②同意參與并簽署知情同意書。

1.2.2 排除標準? ①合并糖尿病、免疫系統相關疾病、腫瘤;②痰培養為非結核分枝桿菌;③合并嚴重疾病;④孕期或哺乳期婦女;⑤HIV感染者及AIDS患者;⑥未收集到完整資料。

1.3 方法

使用EPICS XL流式細胞儀（Beckman Coulter公司，美國）檢測治療前四組的外周血T細胞、NKT、NK細胞表達率。住院第1天清晨采集5 mL空腹肝素鈉抗凝血，進行熒光標記，取100 μL全血與CD3-FITC/（CD16+CD56）-PE抗體室溫下反應20 min，OptiLyse C溶血素溶血，磷酸鹽緩沖液（PBS） 洗滌重懸細胞，流式細胞儀待測。使用EPICS XL SystemⅡTM Version 3.0，分析淋巴細胞的前向散射（FS）與側向散射（SS）細胞分群，在相應的直方圖或散點圖中讀取CD陽性表達率。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用ANOVA，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 四組的不同細胞表達率比較

與Ⅲ組比較，Ⅰ組患者NKT細胞表達率顯著升高，差異有統計學意義（P < 0.05），T細胞及NK細胞表達率差異無統計學意義（P > 0.05）;與Ⅳ組比較，Ⅰ組患者NKT細胞表達率顯著升高，差異有統計學意義（P < 0.05），T細胞及NK細胞表達率差異無統計學意義（P > 0.05）;與Ⅰ組比較，Ⅱ組患者T細胞表達率顯著升高，差異有統計學意義（P < 0.05），NKT細胞及NK細胞表達率差異無統計學意義（P > 0.05）;Ⅲ組T細胞、NK、NKT細胞表達率與Ⅳ組比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見表1。

2.2 Ⅰ組中輕癥、中癥及重癥亞組T細胞表達率比較

Ⅰ組患者中輕癥、中癥及重癥亞組T細胞表達率差異有統計學意義（F = 154.493，P < 0.05），表達率：重癥>中癥>中輕癥。三個亞組的NKT細胞、NK細胞表達率差異無統計學意義（P > 0.05）。見表2。

2.6 治療后隨訪

100肺結核患者治療后均隨訪6個月，2例痰菌復陽，1例病灶惡化，其余均未復發。

3 討論

肺結核的發生與年齡、性別、職業等因素有關[8]，絕大多數患者感染結核分枝桿菌后并不會發病，主要原因是機體受到刺激后，T細胞介導的細胞免疫會抵抗結核分枝桿菌，從而產生獲得性免疫。NK細胞為先天性免疫的重要細胞。NKT細胞可增強免疫反應，在抗腫瘤、感染、治療自身免疫性疾病、移植中起到重要作用。刺激NKT細胞會產生大量細胞因子，如白細胞介素-4（IL-4）及INF-γ等，從而起到免疫調節作用;NKT細胞同時存在NK細胞樣細胞毒活性，可釋放穿孔素、Fas配體等溶解靶細胞，從而起到結核分枝桿菌作用。鄢仁晴等[9]研究表明，肺結核患者NKT水平顯著高于正常者，T細胞及NK細胞則無顯著差異，3種細胞水平與年齡、性別等均無顯著相關性，因此NKT可作為結核病活動性判斷指標。研究[10]表明，NKT和NK細胞在活動性肺結核患者體內表達率高，且NKT水平顯著低于正常及結核病接觸者，且其水平在抗結核治療6個月內一直較低。本研究提示，初、復診的肺結核患者NKT細胞表達率顯著高于健康者，提示肺結核患者細胞免疫異常表現為NKT細胞增加，加劇了細胞毒性效應，患者NKT細胞水平有助于辨認潛伏感染或活動性結核。結核菌素陽性健康者的結核菌相對靜止，未激活NKT細胞，因此其表達與結核菌素陰性健康者類似，均水平較低[11]。但本研究中各組NK細胞表達率差異無統計學意義，與胥萍等[12]研究結果相似。

T細胞通過Th1產生INF-γ、CD8+ T細胞，釋放顆粒素、穿孔素，以殺死結核菌[13-19]。本研究結果提示，初診肺結核患者與健康者比較，T細胞表達水平相當。主要原因可能為：①本研究測定了外周血T細胞，并不能完全代表病灶局部變化;②與健康者相比，肺結核患者CD4+ T細胞水平減少，CD8+ T增加[20-23]。本研究測定CD3+ T細胞，為各亞群變化總和，與健康者相當;③發病前，初診患者T細胞水平偏低，但本組患者均為HIV陰性，發病后T細胞增加，使之與健康者水平相當。本研究結果提示，外周血T細胞與初診患者疾病嚴重程度相關，T細胞增加，疾病更嚴重，預后更不好，但與NKT、NK細胞均無明顯相關性，提示T細胞為主要的免疫反應。與初診患者相比，復診患者T細胞表達率顯著增加，可能是由于已致敏細胞反復暴露于病原菌，激發了強烈增生反應，提示復診肺結核患者免疫反應可能與T細胞所有亞群相關。T細胞檢測有助于了解患者是否復發。

綜上所述，T細胞、NKT細胞是細胞免疫重要組成部分，可誘導結核分枝桿菌特異性免疫反應。初診患者T細胞表達水平與健康者相當，并與疾病嚴重程度相關。復診患者T細胞表達率明顯升高[24-25]。活動性結核患者中NKT細胞表達增加。因此，NKT細胞測定可輔助診斷活動性結核。本研究測定的細胞均為外周血細胞，與真實的病灶細胞可能存在差異。NKT細胞在發病不同階段的免疫效應及表達率的診斷意義及其與不同疾病的關系尚需進一步的研究。

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（收稿日期：2018-07-11? 本文編輯：王? ?蕾）