結核感染T細胞斑點試驗在肺結核和肺外結核診斷中的價值

宋瑞紅 沈魏 魯立文

[摘要] 目的 探討結核感染T細胞斑點試驗（T-SPOT.TB）在肺結核和肺外結核診斷中的應用價值。 方法 選取2014年6月～2017年6月于上海交通大學附屬第六人民醫院南院住院治療的疑診為活動性肺結核和肺外結核的患者200例，進行外周血T-SPOT.TB、皮膚結核菌素試驗（PPD）和萋-尼抗酸染色（AFB）的檢測，并比較3種方法的診斷價值。 結果 T-SPOT.TB、PPD和AFB試驗診斷結核病的敏感性、特異性、陰性預測值及精準度比較，差異有統計學意義（P < 0.05）;T-SPOT.TB診斷肺結核的敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值及精準度高于PPD和AFB（P < 0.05）;T-SPOT.TB診斷肺外結核的敏感性、陰性預測值及精準度均高于PPD和AFB（P < 0.05），而PPD與AFB比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。 結論 T-SPOT.TB診斷肺結核和肺外結核具有較高敏感性和特異性，是快速診斷結核感染的有效手段，值得臨床應用推廣。

[關鍵詞] 結核感染T細胞斑點試驗;肺結核;肺外結核

[中圖分類號] R446.6? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）01（a）-0157-05

結核病一直是危及人類健康的重大傳染病，我國是全球22個結核病高負擔國家之一，目前我國結核病年發病人數約為130萬，位居全球第2位[1]。肺外結核是指發生在肺部以外各部位結核病，可表現為多系統、多部位、多臟器、多類型的結核，臨床表現多樣，缺乏特異性，臨床診斷較肺結核更具有難度，容易漏診和誤診[2]。目前，診斷結核的主要方法包括抗酸染色、結核桿菌培養、病理學檢查和皮膚結核菌素試驗（PPD）等，存在檢出率低、耗時長、有創傷、影響因素廣泛等局限性，對臨床診斷結核幫助有限[3-4]。結核感染T細胞斑點試驗（T-SPOT.TB）是近年來一種新的結核病診斷方法，具有異性好、靈敏度高、快速簡便、耗時少等特點[5]。國外研究已證明T-SPOT.TB對肺結核和肺外結核診斷具有明顯的效果，但國內尚缺乏相關的臨床研究，尤其是肺外結核[6-7]。因此，本研究以活動性肺結核和肺外結核患者為研究對象，觀察T-SPOT.TB的診斷效能，探討T-SPOT.TB在肺結核和肺外結核診斷中的應用價值，旨在尋找快速、準確地結核病診斷方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年6月～2017年6月于上海交通大學附屬第六人民醫院南院（以下簡稱“我院”）住院治療的疑診為活動性肺結核和肺外結核的患者200例，其中男121例，女79例，年齡34～76歲，平均（57.43±8.50）歲，均經結核桿菌培養、組織病理結果、醫學影像學結果及臨床癥狀明確診斷。最終確診結核患者127例，非結核患者73例，結核患者包括肺結核為63例，肺外結核64例，其中肺外結核包括結核性胸膜炎48例、骨結核7例（包括胸椎、腰椎）、結核性腹膜炎3例、淋巴結核2例，泌尿系結核2例，淋巴性腦膜炎1例，附睪結核1例。納入標準：合并咳嗽、咳痰、咳血、消瘦、低熱、乏力等體征和癥狀;檢查胸片時存在肺結核典型改變，檢查痰涂片時存在呈陽性的抗酸桿菌;穿刺檢查胸腔積液時，滲出液為穿刺液，且在液體標本中存在較多的淋巴細胞;通過抗結核治療后，臨床療效顯著，但是抗炎治療的臨床效果不顯著。排除標準：肺結核復治者或初治≥2周者;存在急性病毒性感染、獲得性免疫缺陷綜合征、矽肺、糖尿病、腫瘤或其他會導致免疫功能異常的疾病;人免疫缺陷病毒檢測抗體陽性。本研究已通過我院醫學倫理委員會審核，患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 T-SPOT.TB檢測方法? ①實驗步驟：整個實驗過程嚴格按照試劑盒（oxford immunotec ltd，UK）說明書操作。采集外周血5 mL，采用密度梯度離心法分離制備外周單個核細胞，并移至潔凈離心管中，無血清培養液AIM-V洗滌細胞，去除內源性γ干擾素（IFN-γ）。制備250萬細胞/mL的標準細胞稀釋液，取出培養板，標記并依次加入AIM-V無血清培養液50 μL、抗原A50 μL，抗原B50 μL和陽性對照50 μL，并每孔加入100 μL含25萬PBMC的細胞稀釋液。將培養板放入37℃，5%CO2培養箱中孵育16～20 h，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌4遍，各孔內加入新鮮配制的酶標抗體溶液50 μL，4℃孵育1 h。再采用PBS洗滌4遍，酶聯顯色，干燥培養板。ELISPOT自動計數儀下對斑點進行計數。②結果判定[8]：當陰性對照孔斑點數為0～5，陽性樣本應為：（抗原A或抗原B斑點數）-（陰性對照孔斑點數）≥6;當陰性對照孔斑點數≥6，陽性樣本應為（抗原A或抗原B斑點數）≥2 ×（陰性對照孔斑點數）。

1.2.2 萋-尼抗酸染色法（AFB）和PPD? AFB參照張嫻[9]的方法。PPD采用0.1 mg含5 μl結核菌素，并在72 h后觀察結果。一般陽性反應為硬結直徑≥5 mm，強陽性反應為硬結直徑≥10 mm表示結核感染。

1.3 判定標準

以最終診斷結果為標準，計算T-SPOT.TB、AFB及PPD診斷肺結核和肺外結核的敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值及精確度。敏感性為真陽性人數/（真陽性人數+假陰性人數）×100%;特異性為真陰性人數/（真陰性人數+假陽性人數）×100%;陽性預測值為真陽性人數/（真陽性人數+假陰性人數）×100%;陰性預測值為真陰性人數/（真陰性人數+假陽性人數）×100%;精確度為[真陽性數+真陰性數/（真陽性數+假陽性數+真陰性數+假陰性數）×100%]。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0統計學軟件對數據進行分析。計數資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同方法鑒別診斷結核病的效能比較

T-SPOT.TB診斷為結核病患者135例，其中，最終確診者115例;診斷為非結核病患者65例，其中53例被最終確診;PPD診斷為結核病患者132例，其中，最終確診者101例，診斷為非結核病患者68例，其中42例被最終確診;AFB診斷為結核病患者132例，其中，最終確診者85例，診斷為非結核病患者68例，其中26例被最終確診。T-SPOT.TB診斷結核病的敏感性、特異性、陰性預測值及精準度均高于AFB和PPD（P < 0.05）。見表1。

2.2 不同方法鑒別診斷肺結核和肺外結核的效能比較

T-SPOT.TB診斷為肺結核患者和肺外結核患者分別為65例和62例，最終確診肺結核患者和肺外結核患者分別58例和57例;PPD診斷為肺結核患者和肺外結核患者分別為70例和57例，最終確診肺結核患者和肺外結核患者分別50例和48例;AFB診斷為肺結核患者和肺外結核患者分別為65例和62例，最終確診肺結核患者和肺外結核患者分別45例和44例。T-SPOT.TB診斷肺結核的敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值及精準度均高于PPD和AFB（P < 0.05）。見表2。T-SPOT.TB診斷肺外結核的敏感性、陰性預測值及精準度均高于PPD和AFB（P < 0.05），而PPD與AFB比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見表3。

3 討論

3.1 目前我國結核病診斷現狀

痰涂片結核菌AFB和PPD是我國目前最主要的結核病檢測方法。在無法進行分枝桿菌培養的情況下，痰涂片結核菌AFB可謂診斷肺結核的“金標準”，但是其結果的判斷受到檢測者涂片質量、染色時間、閱鏡經驗等主觀因素影響，同時還受到疾病所處的時期有關，故假陽性率高、漏診率較大[9-10]。PPD的靈敏度水平受患者免疫力狀況、營養狀況、卡介苗接種等多種因素影響，假陽性率較高，大大影響了其臨床應用價值[11]。在本研究中，PPD和AFB對結核病的敏感性分別為79.53%、66.93%，而進一步細化觀察發現，對肺結核的敏感性分別為79.37%、71.42%，對肺外結核的敏感性為75.00%，66.67%，與其他研究結果類似，提示痰涂片結核菌AFB和PPD在臨床中診斷結核病的應用價值都比較低[12-14]。

3.2 T-SPOT.TB在結核病診斷中具有較高的應用價值

近年來，隨著免疫學檢測技術的不斷發展，以酶聯免疫斑點技術（ELISPOT）為檢測方法的結核感染T細胞檢測方法（T-SPOT.TB）作為一種新的結核病診斷方法逐漸建立并發展起來，被廣泛的應用于結核感染篩查[15-16]。感染結核分枝桿菌的機體存在結核特異性記憶T淋巴細胞，當再次遇到結核特異性抗原刺激時，轉化為效應T淋巴細胞，釋放IFN-γ，靶抗原6（ESAT-6）和過濾蛋白10（CFP-10）是結核分枝桿菌復合群基因RD1區域rv3875和rv3874編碼的結核特異性蛋白抗原，可從MTB感染者的T細胞中誘導出較強的IFN-γ釋放反應，根據以上原理而設計的T-SPOT.TB技術是目前最敏感的檢測結核抗原特異性T淋巴細胞的技術[17-18]。在本研究中，T-SPOT.TB診斷結核病的敏感性、特異性及精準度分別為90.55%（115/127）、72.60%（53/73）、84.00%（168/200），均明顯高于AFB和PPD（P < 0.05），提示T-SPOT.TB對結核病的診斷具有較好的效果。

3.3 T-SPOT.TB對肺結核和肺外結核均具有較好的診斷效能

本研究發現，T-SPOT.TB診斷肺結核的敏感性、特異性、陽性預測值及精準度高于PPD和AFB（P < 0.05）。班麗芳[19]研究發現，T-SPOT.TB診斷肺結核的的準確率明顯高于PPD。闞景雙等[20]研究發現，T-SPOT.TB診斷肺結核的敏感性為95.1%，高于包括PPD，血清結核桿菌抗體、痰涂片結核分枝桿菌檢測以及支氣管肺泡灌洗液結核分枝桿菌檢測在內的其他各項檢查方法。肺外結核的臨床表現與多種疾病的表現類似，多在體內較深或隱匿部位，不易獲得細菌學及病理學證據，有些需手術或穿刺活檢確診，但需考慮患者經濟原因及其依從性，很多患者不能接受，診斷難度高于肺結核。因此，肺外結核誤診、漏診極為常見，常因此而延誤治療，嚴重影響患者預后。一項在疑診肺外結核患者中進行的前瞻研究發現，33%伴有免疫功能不全，免疫功能不全的患者中PPD皮試靈敏度僅有38%，而免疫功能正常患者中為69%[21]。本研究發現，T-SPOT.TB診斷肺外結核病的靈敏性為89.06%，高于AFB和PPD（P < 0.05）。T-SPOT.TB的優勢在于不受患者免疫力狀態和排菌期、排菌量的影響[22-23]。研究顯示，通過使用結核分枝桿菌特異性抗原早期分泌ESAT-6和培養CFP-10刺激結核感染后T淋巴細胞，分泌的特異性的細胞因子IFN-γ，并通過ELISPOT技術，應用T-SPOT.TB實驗檢測血液中有無INF-γ，從而可以判斷有無結核分枝桿菌的感染，不僅靈敏度高、特異性強、而且操作簡單、耗時少，一般1～2 d就能看到結果[24-25]。

綜上所述，T-SPOT.TB診斷肺結核和肺外結核具有較高敏感性和特異性，是快速診斷結核感染的有效手段，值得臨床應用推廣。

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（收稿日期：2018-06-01? 本文編輯：封? ?華）