miRNA通過轉錄因子及EMT相關調控蛋白在胃癌侵襲轉移中的作用機制研究

毛竹君，祝利民，盧艷琳，王俊軍，周浩，沈克平#

1上海市中醫藥大學附屬龍華醫院腫瘤科，上海 200233

2上海市青浦區中醫醫院內科，上海 201400

微小RNA（microRNA，miRNA）是一種短鏈非編碼RNA，參與調節人類30%以上編碼蛋白質的基因的表達[1]，在腫瘤發生中可能起促癌或抑癌作用。miRNA的表達與胃癌及其他腫瘤的發生發展密切相關，并在腫瘤相關基因的調節中起重要作用[2]。

研究發現，miRNA的表達與胃癌患者的生存期有關，胃癌組織miRNA-9和miRNA-137表達水平升高與胃癌的TNM分期較晚、局部淋巴結轉移和生存期較短有關，并以CUL4A為靶基因參與胃癌上皮細胞-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的生物學過程[3]。另一項研究采用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測miRNA-124在88例胃癌患者中的表達水平，結果發現miRNA-124的表達與胃癌患者的總生存期（overall survival，OS）密切相關[4]。研究顯示，miRNA-345的表達下調與胃癌患者局部淋巴結轉移和較晚的TNM分期密切相關，miRNA-345的表達水平降低可縮短胃癌患者的OS和無病生存期（diseasefree interval，DFS）[5]。胃癌組織中miRNA-599的表達水平降低，常提示預后較差，與淋巴結轉移和較晚的TNM分期有關。研究顯示，miRNA-599可以預測胃癌患者的5年生存率，預測價值較高[6]。miRNA參與胃癌發生發展生物學過程的具體機制值得深入研究。

EMT不僅可參與正常胚胎發育過程中器官和組織的生成過程，也可促進腫瘤細胞的遷移和侵襲，EMT可使腫瘤細胞的間充質表型發生改變，促進腫瘤細胞的遷移和侵襲[7]。研究顯示，部分轉錄因子、生長因子及相關信號通路均可參與EMT過程[8]，而miRNA可通過調控原癌基因或抑癌基因來調控胃癌細胞的EMT過程。EMT是胃癌細胞侵襲和轉移的關鍵步驟，snail、扭曲蛋白（TWIST）和E盒結合鋅指蛋白（zinc finger E-box binding homeobox，ZEB）等轉錄因子及其他EMT相關作用蛋白的上游靶基因均可能作為預測腫瘤遷移和侵襲的分子標志物。機體發育過程可調控EMT的生物學過程，而機體的發育過程又受到TWIST1、ZEB等一系列轉錄因子的調控，這些轉錄因子又是EMT過程的重要調控因子[9-10]，均可抑制E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達，促進腫瘤細胞的遷移和侵襲。miRNA通過與靶基因信使RNA（messenger RNA，mRNA）的3'非翻譯區（3'-untranslated region，3'-UTR）特異性結合，促使mRNA降解或抑制其翻譯，從而在轉錄后調節靶基因的表達水平。上述機制共同調控胃癌EMT的整個過程。本文就近年來miRNA與胃癌轉錄因子及EMT相關調控蛋白間的關系，及其參與腫瘤遷移和侵襲的分子機制進行綜述。

1 miRNA與轉錄因子snail

snail是重要的EMT轉錄因子，通過與E-pal盒（包含啟動子的2個毗鄰E盒）結合來抑制E-cadherin蛋白的轉錄，從而影響EMT過程，snail過表達與胃癌淋巴結轉移相關[10]，并可作為預測胃癌疾病進展及預后的獨立標志物。miRNA-491-5p可以抑制多種腫瘤的發生發展，其過表達可明顯抑制胃癌EMT過程和腫瘤細胞的侵襲轉移[11]。snail被認為是miRNA-491-5p的目的基因，此外，miRNA-491-5p還可抑制成纖維細胞生長因子4（fibroblast growth factor 4，FGFR4）的轉錄，從而間接下調snail蛋白的表達并抑制胃癌EMT過程。miRNA-30a可與snail基因的3'-UTR結合，并抑制其表達。研究發現，miRNA-30a可能通過靶向調控snail蛋白的表達影響胃癌的EMT過程，從而影響胃癌腫瘤細胞的遷移和侵襲能力，此外，miRNA-124、miRNA-506、miRNA-204及miRNA-203等也被證實具有類似作用[12-15]。

2 miRNA與轉錄因子TWIST

TWIST是堿性螺旋-環-螺旋（basic helix-loophelix，bHLH）轉錄因子家族成員，包括TWIST1和TWIST2兩種類型，均可參與EMT過程，在胃癌腫瘤細胞的遷移和侵襲過程具有重要作用[16]。胃癌細胞和動物模型實驗中均證實，TWIST1能誘導EMT，促進腫瘤侵襲和轉移，miRNA-495過表達可明顯影響腫瘤細胞的存活和遷移能力，促進細胞凋亡并抑制EMT過程，TWIST1是miRNA-495的目的基因，TWIST1沉默后可部分逆轉miRNA-495對胃癌腫瘤細胞EMT過程的抑制作用[17]。miRNA-15a-3p和miRNA-16-1-3p也可影響TWIST1的表達和EMT過程。生物信息學分析表明，TWIST1的3'-UTR含有miRNA-15a-3p和miRNA-16-1-3p兩個結合位點，miRNA-15a-3p和miRNA-16-1-3p過表達可以抑制TWIST1基因3'-UTR的熒光素酶活性，下調N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、α-平滑肌肌動蛋白（αsmooth muscle actin，α-SMA）和纖維蛋白等EMT相關蛋白的表達，抑制基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）和基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）的活性，從而抑制胃癌細胞的遷移和侵襲[18]。

3 miRNA與轉錄因子ZEB

ZEB包括ZEBl和ZEB2兩種類型，二者結構相似，由中間的可變序列將C端和N端的鋅指簇連接起來。C端和N端的鋅指簇能與DNA分子上的CACCT（G）或（C）AGGTG序列結合，從而抑制其下游EMT相關蛋白的靶基因轉錄[19]。此外，ZEB蛋白還具有Smad結合域和羧基末端結合蛋白（C-terminal-binding protein，CtBP）相互作用結構域。研究顯示，ZEB蛋白過表達與腫瘤的發生和轉移密切相關[20]，目前已有研究證實，胃癌組織中存在ZEB的過表達。ZEB通過下調E-cadherin的表達，上調間質表型標志物[波形蛋白（vimentin）、纖維粘連蛋白（fibronectin，FN）和N-cadherin]和基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）的表達，誘導腫瘤細胞發生EMT，促進腫瘤細胞轉移。一般情況下，miRNA-338-3p在胃癌中過表達，其通過ZEB2調控蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）通道抑制胃癌的EMT過程，沉默miRNA-338-3p可引起胃癌細胞表型變化，從而調控N-cadherin、FN和vimentin等EMT相關蛋白的表達[21]。ZEB2作為鈣調蛋白的轉錄抑制因子，miRNA-145-5p可通過抑制N-cadherin及目的基因ZEB2的表達來抑制胃癌細胞的侵襲和轉移，調控胃癌EMT過程[22]。研究顯示，miRNA-200b過表達可以改變胃癌細胞的形態，下調ZEB2mRNA的表達，同時上調鈣調蛋白的表達；此外，miRNA-200b過表達還可以明顯降低腫瘤細胞增殖率，抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲[23]。

4 miRNA與轉錄因子FOX

叉頭框（forkhead box，FOX）基因家族，是一個龐大且功能廣泛的轉錄因子家族，其共同特征是具有一個高度保守的叉頭結構域。研究表明，叉頭框M1（forkhead box M1，FOXMl）蛋白通過調控間充質細胞標志物（ZEBl、ZEB2、snail和Vimentin）的表達來調控胃癌細胞的EMT過程[24]。體外實驗表明，miRNA-345在胃癌組織中低表達，可抑制胃癌細胞的EMT過程，而沉默FOXQ1可以逆轉miRNA-345對EMT的抑制作用，FOXQ1被證實是miRNA-345的下游信號蛋白[5]。miRNA-1271在胃癌組織中的表達下調，且miRNA-1271的表達與腫瘤直徑呈負相關，與局部淋巴結轉移和較晚的TNM分期密切相關。miRNA-1271過表達可明顯抑制胃癌細胞增殖及EMT過程。敲除FOXQ1可以抑制胃癌細胞的惡性轉化，而下調miRNA-1271的表達可促進FOXQ1表達的恢復，因此，FOXQ1被認為是miRNA-1271的直接目的基因[25]。此外，miRNA-194在胃癌組織中表達明顯下調，其過表達可以抑制胃癌細胞侵襲和轉移，并調控胃癌細胞的EMT表型，miRNA-194可以參與FOXM1轉錄后的調控機制[26]。

5 miRNA與其他轉錄因子

SP1在胃癌EMT過程中發揮重要作用，在胃癌組織中表達水平明顯高于正常組織[27]。miRNA-223與SP1基因的3'-UTR結合并抑制其翻譯，采用腫瘤生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）誘導胃癌細胞，成功地建立了細胞EMT模型，miRNA-223過表達可以促進胃癌EMT相關蛋白的表達并抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲能力，從而誘導腫瘤細胞凋亡，SP1基因可以特異性調控miRNA-223/SP1/EMT信號通路抑制胃癌EMT過程[28]。胰島素樣生長因子受體1（insulin-like growth factor receptor 1，IGF1R）致癌基因，是一種細胞生長的重要調節因子，通常在胃癌中過表達并誘導胃癌細胞的EMT過程，與胃癌細胞的侵襲和轉移有關。IGF1R是miRNA-7的直接目的基因，與miRNA-7的表達呈負相關。此外，miRNA-7還可通過調控IGF1R的表達，上調鈣調蛋白的表達，部分逆轉胃癌EMT的過程。研究顯示，miRNA-7/IGF1R/snail信號通路可抑制胃癌細胞侵襲和轉移[29]。胃癌組織中miRNA-148a低表達與淋巴結轉移有關，miRNA-148過表達可通過下調vimentin的表達和上調鈣調蛋白的表達來抑制胃癌細胞的轉移，其目的基因是轉錄因子SMAD2[30]。血清應答因子（serum response factor，SRF）也可以調控胃癌細胞侵襲和轉移。研究顯示，SRF在侵襲能力較高的胃癌細胞中表達水平較高，并與胃癌患者的不良預后密切相關。SRF/miRNA-199a-5p/鈣調蛋白通路可促進胃癌細胞EMT過程并提高其轉移能力[31]。miRNA-144-3p在胃癌組織中的表達明顯下調，且miRNA-144-3p的表達水平與腫瘤的浸潤深度、腫瘤直徑、淋巴結轉移和TNM分期有關。B淋巴細胞白血病轉錄因子3（pre-B-cell leukemia transcription factor 3，PBX3）可促進胃癌細胞的EMT過程，是miRNA-144-3p的直接目的基因。

6 小結

隨著生物技術的不斷發展和人們對miRNA認識的不斷加深，越來越多miRNA的生物學功能被發現。部分研究證實，miRNA具有作為胃癌治療靶點的潛在價值，但其在胃癌發生發展中的作用機制仍未十分明確，尚需進一步利用miRNA模擬物或拮抗物進行更多的體內外研究證實。了解miRNA調控相應靶基因的作用機制，并據此對腫瘤細胞進行基因或藥物靶向治療，可以促使miRNA或靶基因的異常表達恢復至正常水平，或降低其異常表達水平，提高胃癌的診斷、治療水平，改善預后。