上皮-間充質轉化在胃癌中的研究進展

劉駿強，徐岷

江蘇大學附屬醫院消化內科，江蘇鎮江212000

胃癌是世界范圍內第五大常見惡性腫瘤，其病死率居全球惡性腫瘤第3位，而東亞地區是全球胃癌發病率最高的地區[1]。目前，外科切除是胃癌唯一有效的治療方式，但胃癌的早期診斷及治療仍面臨挑戰，多數患者確診時往往已經失去了手術根治的機會。因此，針對胃癌發生、發展的研究顯得十分重要。近年來研究發現，上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）與多種腫瘤的發生及腫瘤細胞的增殖、遷移及侵襲密切相關[2]。因此，本文針對EMT在胃癌中的研究進展作一綜述。

1 EMT特征

細胞間各種連接及細胞極性維持了上皮細胞的完整性。在脊椎動物細胞中，上皮細胞連接包括緊密連接、黏附連接、縫隙連接和橋粒。另外，不同極性蛋白復合物分別定位于細胞頂端、細胞基底外側區域，共同奠定細胞頂端-基底端極性基礎。通常情況下，EMT是指上皮細胞逐漸失去細胞間連接及頂端-基底端極性，進而重組肌動蛋白構建新的細胞骨架，誘導板狀偽足、絲狀偽足及侵襲性偽足形成，同時促進基質金屬蛋白酶的表達來降解細胞外基質，因此獲得具有間質細胞的遷移及侵襲能力的可逆過程。EMT可分為3種類型，Ⅰ型EMT與胚胎發育有關，Ⅱ型EMT與組織再生與傷口愈合有關，Ⅲ型EMT與腫瘤發生、發展及腫瘤干細胞功能有關[3]。EMT應激啟動后，上皮細胞的細胞連接解構，相關連接蛋白重新定位或降解[4]。同時，極性蛋白復合物的表達也受到抑制，上皮細胞失去典型的鵝卵石形態，變成紡錘樣間質細胞形態，從而失去細胞完整性，細胞黏附能力降低，遷移能力提高，進而誘導腫瘤細胞從原發灶脫離，甚至浸潤游走至遠端部位[5]。

目前，已有研究發現，EMT相關蛋白標志物可以反映細胞的形態轉變[6]。EMT過程中，上皮細胞黏附連接丟失，其關鍵蛋白E-鈣黏蛋白（E-cadherin，CDH1）轉化為間質細胞標志物N-鈣黏蛋白（N-cadherin，CDH2），從而導致CDH1表達下調和CDH2表達上調。此外，鈣黏蛋白間的轉化受到EMT相關轉錄因子的調控，細胞應激后EMT轉錄因子發生核易位，如SNAIL家族、E盒結合鋅指蛋白（zinc finger E-box binding homeobox，ZEB）可以直接或間接地抑制CDH1表達，促進CDH2、波形蛋白（vimentin）等表達，這些轉錄因子對EMT關鍵蛋白的調控機制進一步證明了EMT在腫瘤生物學運動中的重要作用[7]。

2 信號通路

胃癌細胞在腫瘤微環境中受到生長因子、缺氧、炎性因子、新陳代謝等不同信號分子刺激后，應激激活相關信號通路，刺激下游轉錄因子參與EMT過程，進而影響其增殖、遷移及侵襲等生物學運動。

2.1 WNT/ β-連環蛋白通路

經典WNT/β-連環蛋白（β-catenin）通路可以參與調控腫瘤細胞的EMT，β-catenin可以直接與細胞內的CDH1結合，而α-連環蛋白連接肌動蛋白，三者形成的復合物可以維持上皮細胞的穩定及黏附；同時，鈣黏蛋白-連環蛋白復合物也可以抑制βcatenin的核轉移。細胞中WNT配體和受體結合應激后，可以抑制糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）/軸蛋白（axin）/大腸腺瘤樣息肉（adenomatous polyosis coli，APC）蛋白復合物磷酸化降解細胞內游離的β-catenin；而細胞內βcatenin逐漸積聚后，可以轉入細胞核內進一步與T淋巴細胞趨化因子（T lymphocyte chemotactic factor，TCF）/淋巴樣增強因子（lymphoid enhancer factor，LEF）結合，促進EMT轉錄因子SNAIL、TWIST的表達，抑制CDH1的表達，進而促進胃癌細胞的遷移、侵襲[8]。另一方面，CDH1負性調控WNT通路，伴隨細胞間連接分解，CDH1和β-catenin結合分解，釋放的β-catenin積聚在細胞質中，β-catenin在WNT信號啟動時發生核易位。

此外，非經典WNT通路也參與了EMT過程，比如過表達WNT5A可以增強胃癌細胞中SNAIL、vimentin、CD133蛋白及信使RNA（messenger RNA，mRNA）的表達水平，反之低表達WNT5A則可以抑制EMT及腫瘤干細胞的活性[9]。

2.2 TGF-β/SMAD信號通路

轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）/SMAD信號通路可以參與調節多種腫瘤細胞的EMT過程。TGF-β與轉化生長因子-β受體（transforming growth factor-β receptor，TGF-βR）（TGF-βR1、TGF-βR2）相結合，可以磷酸化下游信號轉導分子SMAD家族成員2（SMAD family member 2，SMAD2）、SMAD 家族成員 3（SMAD family member 3，SMAD3）；SMAD2、SMAD3、SMAD家族成員4（SMAD family member 4，SMAD4）結合后形成三聚體復合物并進入細胞核，激活EMT諸多轉錄因子，進而促進CDH1降解，增高CDH2表達水平[10]。不僅如此，TGF-β/SMAD信號通路還可以協調其他信號通路[WNT/β-catenin通路、Notch通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路等]維持腫瘤間質細胞表型[11]。比如抑癌基因RUNX3的缺失可以誘導TGF-β、WNT通路異常調節，進而促進胃EMT過程并增強干細胞活性蛋白——富含亮氨酸重復單位的G蛋白偶聯受體5（leucine rich repeat containing G protein-coupled receptor 5，LGR5）的表達[12]。

2.3 MAPK信號通路

MAPK是一個高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，參與腫瘤細胞基本生物學運動。MAPK通常有細胞外信號調節激酶（extracellular signalregulated kinase，ERK）-MAPK、p38-MAPK、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和BMK（ERK5）4個級聯信號通路，且各個級聯信號通路均可以通過EMT促進胃癌細胞的遷移和侵襲。凋亡因子FAS配體介導的胃癌細胞可以通過ERK1/2抑制GSK-3β的磷酸化，進而減弱GSK-3β對β-catenin降解作用，并促進β-catenin、SNAIL蛋白在細胞核內積聚，誘導胃癌細胞EMT，而且β-catenin、SNAIL蛋白表達可以被ERK抑制劑U0126所阻斷[13-14]。另外，抑癌基因RASSF6可以抑制p38的磷酸化，減弱胃癌細胞上皮向間質表型的轉變，同時p38-MAPK抑制劑SB203580可以逆轉Ras關聯結構域家族成員6（（Ras association domain family member，RASSF6）對p38磷酸化的調控，減弱EMT進程[15]。此外，活化JNK通路可以促進胃癌細胞EMT，反之JNK抑制劑也可以逆轉EMT進展，削弱胃癌細胞的遷移能力[16-17]。雖然關于BMK通路的研究較少，仍有文獻報道煙草煙霧可刺激小鼠胃組織ERK5的磷酸化，進而誘導EMT發生，提示吸煙是胃癌發生的風險因素[17]。

2.4 Notch信號通路

Notch信號通路：哺乳動物通常具有Notch受體（NOTCH1～4）和配有DSL（DELTA/serrate/LAG2）結構域的典型配體（DLL1、DLL3、DLL4、Jagged1、Jagged2）。經典Notch途徑下，配體與受體結合后，可以激活Notch胞內結構域（Notch intracellular domain，NICD）轉移至細胞核，與目的蛋白形成二聚體，進而促進下游基因轉錄；而活化Notch信號能夠調控胃癌EMT相關蛋白的表達。如NOTCH1與其配體結合后，可以刺激NICD和β-catenin轉入細胞核形成復合物，從而促進上皮形態標志物CDH1的表達，抑制間質形態標志物CDH2和vimentin的表達，促進胃癌細胞增殖，抑制胃癌細胞凋亡[18]。另外，NOTCH1受體與Jagged1配體結合后，NICD1應激誘導信號轉導及轉錄激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）磷酸化，增強EMT啟動子TWIST的活性，進而促進胃癌細胞生長[19]。近年來研究發現，Notch信號通路可以協同其他信號通路影響胃癌細胞EMT，磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，也稱AKT）信號通路激活可以鞏固NICD/β-catenin復合物的穩定性[18]。NOTCH4也可以通過促進WNT1的表達，促進βcatenin進入細胞核，進一步上調下游c-myc和細胞周期蛋白（cyclin）D1的表達，通過WNT1/β-catenin通路促進胃癌細胞生長[20]。更值得關注的是，Notch受體可以根據不同的腫瘤類型表現為癌基因或抑癌基因，其受體表達水平和信號級聯的多樣性可能是原因之一。有文獻報道，NOTCH2可以通過PI3K/AKT信號通路抑制胃癌細胞的侵襲能力，從而證實了NOTCH2的抑癌作用[21]。上述研究表明，Notch信號通路在胃癌發生、發展機制的研究中仍需進一步完善。

2.5 PI3K/AKT信號通路

PI3K/AKT信號通路在胃癌細胞EMT中發揮著重要作用。當胃癌細胞受到外界刺激后，AKT的絲氨酸第473位點或蘇氨酸第308位點磷酸化，下游信號雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，MTOR）及核因子-κB（nuclear factor of kappa B，NF-κB）磷酸化增強，負性調節分子第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（ph osphates and tensin homologue deleted on chromosome ten gene，PTEN）表達下調，進而促進EMT發生[3]。GSK-3β為AKT的主要靶標，激活AKT可以促進GSK-3β的磷酸化降解，進而抑制GSK-3β對β-catenin的降解，因此PI3K/AKT信號通路可以協同WNT信號通路參與調控胃癌細胞EMT。與多柔比星敏感胃癌細胞株相比，質子泵抑制劑泮托拉唑可以減少多柔比星耐藥SGC7901/ADR細胞株中 AKT、GSK-3β的磷酸化，通過 AKT/GSK-3β/βcatenin信號通路逆轉耐藥細胞株EMT進展，從而抑制多柔比星耐藥胃癌細胞株的遷移及侵襲[22]。

3 miRNA和胃癌EMT

微小RNA（micro RNA，miRNA）是真核生物中一類具有調控功能的非編碼RNA，由20～25個核苷酸組成，miRNA可以通過對自身表達水平的改變調控相關目的基因的表達，從而發揮癌基因或抑癌基因的作用。miRNA參與調控多個腫瘤的發生發展，包括對胃癌細胞EMT的影響[23]。

miRNA-506通過與SNAIL2miRNA的3'-UTR結合，抑制SNAIL2的表達，進而上調CDH1表達[24]。高表達的miRNA-204通過直接靶向Ⅱ型轉化生子因子-β受體（transforming growth factor-β receptor typeⅡ，TGF-βR2），抑制SMAD2、SMAD3磷酸化，從而抑制胃癌細胞上皮形態向間質形態的轉變，提高胃癌細胞對5-氟尿嘧啶的敏感性[25]。而上調miRNA-544a表達可以抑制WNT信號通路GSK-3β/axin/APC復合物中軸抑制蛋白（axis inhibition protein 2，AXIN2）的表達，促進β-catenin核易位，上調vimentin、SNAIL1、ZEB1的表達及促進CDH1的降解[26]。另外，部分miRNA還具有促進EMT的作用。miRNA-592可以通過協同PI3K/AKT信號通路和MAPK/ERK信號通路誘導EMT，并促進胃癌細胞的增殖、遷移及侵襲[27]。miRNA-181a-5p參與了RASSF6介導的胃癌細胞EMT，為晚期胃癌的治療提供了一個潛在靶點[15]。

4 幽門螺桿菌和胃癌EMT

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，HP）是一種革蘭陰性桿菌，通過利用自身螺旋的特性及鞭毛的蠕動穿過黏液層，定植在黏液下層和胃黏膜上皮表面。HP可以誘導胃黏膜發生慢性炎性反應、消化道潰瘍，甚至逐步進展到胃癌。早在1994年，世界衛生組織（WHO）將HP感染定義為人類Ⅰ類（即肯定的）致癌原。HP可以誘導胃黏膜相關淋巴組織（mucosa-associated lymphoid tissue，MALT）淋巴瘤的發生、發展[28]，經抗HP治療后，部分胃MALT淋巴瘤患者的癥狀改善，淋巴瘤消失。2005年，Marshall和Warren因為證實了HP的存在獲得了諾貝爾獎。

HP通過誘導宿主上皮細胞EMT參與早期胃癌的發生、發展過程。Choi等[29]對根除HP與EMT進行相關性研究，結果發現陰性對照組、異型增生組和胃癌組受試者的活檢組織中EMT相關基因（TWIST、SNAIL、SLUG、vimentin）的mRNA 表達水平依次遞進升高，而CDH1mRNA的表達水平逐漸降低；該研究還發現，根除HP感染1年后，陰性對照組受試者的活檢組織中TWIST、SNAIL、SLUG、vimentin的mRNA表達水平均較HP感染陽性時明顯下降，而CDH1mRNA表達水平較HP感染陽性時增高，且該種差異在胃癌組中更加明顯。

在HP影響EMT機制研究中發現，細胞毒素相關基因 A（cytotoxin associated gene A，CAGA）是HP分泌的主要毒素因子。CAGA進入宿主細胞內后，自身羧基端磷酸化形成一個信號中樞，可以招募多種蛋白質與其結合。HP可以直接粘附在胃上皮細胞，尤其是上皮細胞間連接處。CAGA既可以重新定位緊密連接相關蛋白閉鎖小帶蛋白-1（zonula occludens-1，ZO-1）、連接黏附分子（junctional adhesion molecule，JAM）以及黏附連接蛋白CDH1至菌株帶，也可以抑制極性蛋白酶活化受體1（protease-activated receptor 1，PAR1）和非典型蛋白激酶C（atypical protein kinase C，aPKC）的活性，使細胞失去頂端-基底端極性。同時，伴隨鈣黏蛋白-連環蛋白復合物中CDH1蛋白的降解，β-catenin核轉位增強，共同誘導EMT的發生、發展[30]。另外，體外實驗發現，CAGA可以通過直接抑制GSK-3β的活性，減弱β-catenin降解，同時促進SNAIL轉錄因子表達，激活WNT/β-catenin通路，進而促進EMT進展[31]。已有研究發現，CAGA可以誘導癌基因Yes相關蛋白（Yes-associated protein，YAP）的表達并促進其進入細胞核，通過YAP通路促進EMT進程[32]。

5 小結

綜上所述，EMT在胃癌發生和胃癌細胞的增殖、遷移及侵襲中扮演重要角色，不同信號因子刺激腫瘤細胞可以通過諸多機制通路影響EMT，調控胃癌生物學運動。由于EMT進程是可逆的，因此有希望通過干預相關有效靶點逆轉胃癌EMT，從而為今后胃癌的治療提供可靠的理論依據。