低濕脅迫對昆蟲病原線蟲生物學特性的影響

吳 霞，朱小芳，馬彩玲，楊亞賢，呂小芳，馬宏萍，劉長仲，錢秀娟

(甘肅農業大學 植物保護學院/甘肅省農作物病蟲害生物防治工程實驗室，甘肅 蘭州 730070)

昆蟲病原線蟲(entomopathogenic nematodes，EPN)是體內攜帶具病原性的共生細菌，能使節肢類動物發病并死亡的一類線蟲[1]，是對靶標昆蟲具較高控制效能的生防因子。利用昆蟲病原線蟲防治害蟲其優點為寄主范圍廣、可以人工大量繁殖、操作簡單、用常規的噴灑裝置或沖洗系統即可使用；線蟲可以主動尋找寄主，對土棲和隱蔽的鉆蛀性害蟲效果好；線蟲對環境安全，可與一些殺蟲劑混用[2-4]。昆蟲病原線蟲不僅作為室內研究的對象，并作為替代化學殺蟲劑的環境友好型生防因子，被人們所接受和應用，如美國佛羅里達州每年大約有25 000 hm2柑橘類植物施用昆蟲病原線蟲[5-7]。

昆蟲病原線蟲營自由生活階段，要面臨各種非生物脅迫，包括高溫、低濕、紫外輻射(UV-B)、化學感應、土壤紋理等[8]；在實際應用中，決定昆蟲病原線蟲對害蟲的控制效果的關鍵因子之一，是在各種非生物因子的脅迫下，EPN能否在田間建立種群[9-10]。因此，研究非生物脅迫對昆蟲病原線蟲的影響，具有重要意義。EPN多分布于相對濕潤的地區，尤其分布于沿海沿江地區，相對濕度較低(50.5%)時，在36 h內會被致死[9,11]，充分說明低濕脅迫是影響昆蟲病原線蟲種群及其分布的重要因子；另一方面，昆蟲病原線蟲對隱蔽性害蟲的田間應用廣泛，而其對葉面害蟲的防治，有較好的控制效能，但在田間控制效能會有所降低，其影響原因就是低濕脅迫[11]。

甘肅省大部分地區干旱少雨，在大田條件下昆蟲病原線蟲對葉面害蟲防治效果不顯著，分析低濕脅迫對昆蟲病原線蟲生物學特性的影響，是提高其控制效能和擴大其應用范圍的關鍵因子[12-15]。因此，了解昆蟲病原線蟲對低濕脅迫的適應性，對昆蟲病原線蟲在干旱地區的應用有著重要的意義，且可以加大甘肅省土著昆蟲病原線蟲的應用。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試寄主昆蟲大蠟螟。試驗用5齡幼蟲，平均質量為0.3 g，使用前需經滯育處理防止其吐絲，化蛹[16-17]。

昆蟲病原線蟲為異小桿線蟲Heterorhabditismegidis0627M、H.brevicaudis0641TY、H.marelatu06 39G；

斯氏線蟲Steinernemafeltiae0619HT、S.bicornutum0631PG、S.affine0619M、S.kraussei0657L、S.karii0663YC，均由甘肅省農作物病蟲害生物防治工程實驗室提供。

昆蟲病原線蟲均用White trap法，由大蠟螟老熟幼蟲培養、繁殖，試驗用的感染期線蟲(Infectivejuveniles，縮略為IJs)均新鮮培養，并用0.2%柳硫汞進行表面消毒，貯存于4℃備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 昆蟲病原線蟲的擴繁 參照文獻[1]的方法進行。于相同規格的培養皿中，底部墊兩層濾紙，每皿放入10頭大蠟螟，將線蟲懸浮液用移液槍移至培養皿；每隔8 h觀察大蠟螟的死亡情況，將死亡的大蠟螟移入擴繁收集盤中收集，備用。

1.2.2 低濕處理后線蟲存活率的測定 在直徑為90 mm的培養皿內墊兩層濾紙，加適量水使其濕潤，將1 mL線蟲懸浮液(1000 IJs/mL)移入，置于相對濕度為50.5%，溫度25℃的小空間濕度控制器中，低濕脅迫處理5，7及9 h后置于50.5%濕度條件復蘇，每處理重復10次；復蘇24 h后檢查線蟲存活情況并計算存活率；統計分析數據，篩選出經不同時長低濕處理，存活率高的昆蟲病原線蟲品系。

1.2.3 低濕處理線蟲復蘇后對大蠟螟的致病力的測定 采用改良的ONE ON ONE法測定。于24孔板中，每孔放2 g經滅菌的細沙，加無菌水使其含水量為15%(w/w)，每孔放1頭大蠟螟Galleriamellonella5齡幼蟲，將篩選出存活率較高的線蟲品系置于滴入(劑量30 IJs/孔)不同的線蟲品系為不同處理，以未經低濕處理的線蟲作對照，每處理重復30次，置(25±1)℃ 晝/(18± 1)℃ 夜；8 h 晝/16 h 夜；RH 80%條件下恒溫箱內。每隔8 h檢查大蠟螟的死亡情況并做記錄，比較不同濕度昆蟲病原線蟲對大蠟螟致病力的影響；統計分析數據，得出不同時長的低濕處理對大蠟螟致病力的變化。

1.2.4 低濕處理線蟲復蘇后對大蠟螟的生殖力測定 采用以大蠟螟為寄主昆蟲的White Trap繁殖法。將篩選出存活率較高的線蟲品系置于培養皿中，培養皿墊濾紙并使其濕潤，每個培養皿中加入8頭大蠟螟及經低濕處理的昆蟲病原線蟲1 000頭，以未經低濕處理的線蟲作對照，3次重復。每隔8 h檢查大蠟螟的死亡情況并稱重，放入線蟲擴繁收集盤中，收集并計算每克大蠟螟產生的線蟲數量。測定低濕處理對昆蟲病原線蟲生殖力的影響。

2 結果與分析

2.1 低濕脅迫對昆蟲病原線蟲存活率的影響

不同種類或品系昆蟲病原線蟲在低濕條件下，其存活率不同。S.feltiae0619HT、S.bicornutum06 31PG、S.affine0619M、S.kraussei0657L、S.karii0663YC、H.megidis0627M、H.brevicaudis0641TY、H.marelatu0639G 8種昆蟲病原線蟲經過低濕條件的處理，3種異小桿線蟲的存活率較5種斯氏屬線蟲低，說明異小桿線蟲抗低濕脅迫能力較斯氏線蟲弱，其中S.kraussei0657L抗低濕脅迫能力最強。

圖1 低濕處理下昆蟲病原線蟲的存活率Fig.1 Effects of low humidity stress on survival rate of entomopathogenic nematodes

通過對8種昆蟲病原線蟲低濕處理7 h 后，發現其中5種斯氏屬線蟲0619HT、0631PG、0619M、0657L、0663YC的存活率均高于72.5%，與其他存活率均低于50%的3種異小桿屬線蟲0627M，0641TY和0639G相比，有顯著性差異(P<0.05)。其中，斯氏屬線蟲0619HT、0631PG兩種的存活率低于80%，與0619M、0657L、0663YC 3種存活率均高于85%的線蟲相比，有顯著性差異(P<0.05)。經9 h低濕脅迫處理后，斯氏屬線蟲仍有較高的存活率且高于70%，0657L的存活率仍是80.3%，且明顯高于供試的其他4 種斯氏屬線蟲，且有顯著性差異(P<0.05)；異小桿屬線蟲在經過7 h 低濕脅迫處理后，0627M的存活率為37.6%，與0641TY和0639G有顯著性差異(P<0.05)，其存活率分別為3.8%和7.7%；在對異小桿屬線蟲0639G，0641TY和0627M低濕脅迫處理9 h后，0639G 和0641TY全部死亡，0627M存活率7.5%，3種之間沒有顯著性差異(P>0.05)。

2.2 低濕脅迫對昆蟲病原線蟲致病力的影響

據對昆蟲病原線蟲存活率受低濕脅迫處理影響的研究結果，對篩選出較抗低濕脅迫的5種斯氏屬線蟲0619HT、0631PG、0619M、0657L、0663YC進一步研究低濕脅迫對其致病力的影響。

結果顯示，先將侵染大蠟螟的線蟲經過低濕脅迫處理后復蘇，再對大蠟螟進行侵染，線蟲對大蠟螟的侵入率均有不同程度的下降，而致死率只有S.affine0619M下降，其余4種無明顯變化。經9 h 低濕處理后再復蘇，大蠟螟在被5種斯氏線蟲侵染48 h之后，用0619HT、0631PG、0657L和0663YC侵染大蠟螟時，供試大蠟螟全部死亡，即累積死亡率均為100%，與沒有經過低濕處理的對照組沒有顯著性差異(P>0.05)，而0619M為75%，和對照有顯著性差異(P<0.05)；5種線蟲對大蠟螟的侵入率與對照組相比均下降，其中0663YC下降最明顯，與0631PG、0619M、0657L有顯著性差異(P<0.05)。綜上所述，經過低濕處理，昆蟲病原線蟲的侵入率會降低，但是對其致病力除0619M外，沒有顯著影響(圖2)。

2.3 低濕脅迫對昆蟲病原線蟲生殖力的影響

經低濕脅迫處理后，S.felitiae0619HT和H.megidis0627M的生殖力均有不同程度的下降，但各處理與對照組比較，生殖力差異不顯著(P>0.05)。不同的輻射時長，除H.megidis0627M經7 h脅迫處理

圖2 5種斯氏線蟲經低濕處理復蘇后的致死率和侵入率Fig.2 Effects of low humidity stress on fatality rates and infection rates of 5 species of Steinernema

后生殖力與對照存在差異外，其余處理均無顯著差異(P>0.05)。說明低濕脅迫對昆蟲病原線蟲生殖力無顯著影響。不同種類昆蟲病原線蟲，其生殖力變化趨勢不同。S.felitiae0619HT隨低濕脅迫處理時間增加，其生殖力上升。S.felitiae0619HT經過低濕處理5 h后，產生的線蟲數為33 693.48條/g，線蟲生殖力較對照組下降22 717.60條/g，經過低濕處理7 h后，產生的線蟲數為39 542.80條/g，線蟲生殖力較5 h上升了5 849.32條/g，經過低濕處理9 h后，產生的線蟲數為81 547.18條/g，線蟲生殖力較7 h上升了42 004.38條/g；而H.megidis0627M隨低濕脅迫處理時間增加，其生殖力下降，經低濕處理5 h后，產生的線蟲數為48 278.96條/g，生殖力較對照組下降了6 357.96條/g，H.megidis0627M隨低濕脅迫處理時間增加，其生殖力有下降趨勢。說明不同昆蟲病原線蟲的生殖適應能力經低濕脅迫處理后發生變化。低濕脅迫對S.felitiae0619HT和H.megidis0627M的生殖力無顯著影響，S.felitiae0619HT經低濕脅迫后，隨脅迫時間的增加，生殖力有升高趨勢(表1)。

表1 低濕脅迫處理下昆蟲病原線蟲的生殖力

3 討論

EPN作為一種活體生物，對其基本生物學特性產生最顯著的影響是非生物脅迫(逆境)。試驗表明，昆蟲病原線蟲在逆境脅迫條件下，其存活率、致病力、侵入率和生殖力等會發生改變[8,10]，而且線蟲的不同種類、同種類的不同品系、同品系的不同階段，其抵抗非生物脅迫的能力也有所不同[12]。抗逆性幼蟲(侵染期線蟲)daner juvenile，是昆蟲病原線蟲(EPN)的生活史中，抵御和適應逆境脅迫的最佳階段。逆境脅迫對抗逆性幼蟲的影響及塑造，及抗逆性幼蟲對逆境脅迫的適應能力及反應，直接決定了IJs能否通過逆境脅迫存活。結果表明，低濕脅迫對線蟲存活有影響，但在一定的相對濕度和低濕脅迫時長內，大部分供試的斯氏屬線蟲能存活并完成生活史，說明甘肅省昆蟲病原線蟲對低濕脅迫有一定的適應性和抗逆性。

EPN對逆境脅迫的耐受程度首先取決于它的遺傳特性，因此不同的線蟲在相同的脅迫因子的影響下有不同的耐受力；其次，同種線蟲在對不同棲境的長時間適應下，其抗逆性也會改變以適應生境。研究結果表明，不同EPN經低濕脅迫處理后，其致病力會相應的發生不同程度的變化，與以往研究結果相似。

Shapiro等[9]的研究結果表明，在低濕脅迫下(50%)，EPN在90 min 內會死亡。試驗所篩選出的S.kraussei0657L經低濕脅迫處理9 h后，其存活率為為80.3%。陳松筆等[18]的研究報道，低濕脅迫9 h 后S.carpocapsaeCB-16 品系具有較高的抗低濕脅迫能力，存活率為85.3 %[18]。均說明昆蟲病原線蟲的抗低濕脅迫能力在不同種類和分布區域之間存在差異。試驗表明，供試的8 種EPN中，5種斯氏屬線蟲和1種異小桿屬線蟲經低濕脅迫處理5 h 后存活率均在74%，說明甘肅省本土分類獲得的昆蟲病原線蟲，經過試驗，在供試的8種昆蟲病原蟲中，有5種斯氏線蟲和1種異小桿屬線蟲通過低濕條件處理5 h ，仍有74%存活率，證明其對低濕脅迫的抗逆性較強。通過這一生物習性的發現，可以將昆蟲病原線蟲的應用范圍向干旱地區擴展，并提高其對葉面害蟲的控制效能。

昆蟲病原線蟲領域研究的熱點，一直是低濕脅迫對昆蟲病原線蟲的影響及其抗低濕脅迫能力和適應力，有報道昆蟲病原線蟲對葉部害蟲防治效果的主要限制因子是低濕脅迫[19-20]。但是，結合此次試驗結果，在一定的脅迫時長內，低濕脅迫對昆蟲病原線蟲的致病力無顯著影響，因此，是否是UVB影響昆蟲病原線蟲遷移能力[21]，使其不能接近和侵染靶標昆蟲，進而使線蟲對葉部害蟲防治效果降低，還是因為葉面干燥影響其對靶標昆蟲的致病力，還需進一步研究。

4 結論

甘肅省分離得到的昆蟲病原線蟲在低溫脅迫方面有較好的抗逆適應能力，異小桿線蟲抗低濕脅迫能力較斯氏屬線蟲弱，其中S.kraussei0657L抗低濕脅迫能力最強；低濕脅迫能使昆蟲病原線蟲的侵入率降低，但是對其致病力無顯著影響；且低濕脅迫對斯氏屬S.felitiae0619HT和異小桿屬H.megidis0627M的生殖力無顯著影響。