不同溫度下TBBPA對日本虎斑猛水蚤攝食和富集的影響?

陳 香， 朱麗巖， 王 超， 董輝輝， 沈 陽， 卜亞謙

(中國海洋大學海洋生命學院，山東 青島 266003)

四溴雙酚A (tetrabromobisphenol-A, TBBPA)是一種持久性有機污染物(Persistent Organic Pollutants, POPs)，易于在生物體內富集，可在食物鏈和食物網中傳遞并產生毒性效應[1-2]。另外，作為市場需求量最大的新型溴代阻燃劑(Brominated Flame Retardants, BFRs)[3-4]，TBBPA的污染問題日益嚴峻，有研究表明，在空氣、水體、沉積物和土壤等介質以及水生生物甚至人體中都檢測到了TBBPA的存在[5]。

橈足類是浮游動物中最重要的組成部分，因其對污染物敏感，常被用來檢測海洋污染與評估風險[6-7]。日本虎斑猛水蚤(Tigriopusjaponicus)是研究河口和海洋生態污染的模式物種，具有分布廣、易培養、生態特征顯著等特點。目前，橈足類已被廣泛應用于毒性效應研究，徐東暉等、Ida Beathe等和鞏文靜等分別研究了多環芳烴、Hg和TBBPA對橈足類的毒性效應[10-12]。Kyun-Woo Lee等和Foley等分別指出污染物對日本虎斑猛水蚤的世代毒性和耐受力的影響[13-14]。另外，Shi等研究了HBCD在日本虎斑猛水蚤體內的急性積累與發育毒性[8]。

溫度是影響橈足類生長和繁殖的重要因素[15]。溫度變化對污染物毒性效應的影響已成為研究的焦點。Santhanam P等和Alexander K等分別研究不同的溫鹽度對橈足類的毒性效應[16-17]。李光福等和韓萃等分別研究了溫度和鹽度對指狀偽鏢水蚤(Pseudodiaptomidaeinopinus)攝食和繁殖的影響以及溫、鹽度對擬長腹劍水蚤(Oithonasimilis)生長發育的影響[15,18]。胡媛媛和Kaisa Figueiredo分別測量了不同物質在水生生物中的積累[19-20]。目前，關于環境因子作用下污染物在橈足類體內多世代積累方面的報道較少。因此，本研究在攝食、產糞的基礎上系統探究了溫度對日本虎斑猛水蚤多世代積累TBBPA的影響，為自然環境下TBBPA在水生生物體內的富集提供數據，有利于建立完善合理的TBBPA毒性評定標準。

1 材料與方法

1.1日本虎斑猛水蚤的培養

日本虎斑猛水蚤最初采集于山東省青島市匯泉灣附近海域，已在實驗室連續培養3年以上。日本虎斑猛水蚤的培養條件為溫度(20±1) ℃、鹽度30、光照周期12 h L∶12 h D。喂養青島大扁藻(PlatymonashellgolandicaKylinvarTsingtaoensis)、三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)和活性干酵母溶液的混合餌料，投喂比例為5∶1∶2。

1.2 測試化學品

TBBPA固體從J&K化學試劑有限公司購買。根據以往文獻中的標準設計，用二甲亞砜(DMSO)配制濃度為10 g/L的溶液，隨后用過濾海水稀釋至50 mg/L并用于之后的實驗。

1.3 實驗方法

1.3.1 急性毒性測試 實驗設有空白對照組、溶劑對照組D(DMSO)、1.59、2.385、3.577、5.366、8.049和12.07 mg·L-1TBBPA共八組。每組三個平行。每個平行組20只日本虎斑猛水蚤。實驗條件同培養條件。每24 h記錄水蚤死亡數并將死亡個體挑出。實驗持續48 h并計算48 h-LC50[18,24]。

1.3.2 攝食實驗 根據預實驗，設定日本虎斑猛水蚤的實驗溫度為18、20、23 ℃，馴化一周后開始實驗。實驗開始前饑餓處理24 h。采用餌料濃度差法計算攝食率和濾水率[21]。

根據急性毒性測試結果，將實驗的TBBPA濃度分別設定為48 h-LC50的1%、2.2%、5%、11%，并設置一個溶劑對照組、一個不加水蚤的藻液參照組，每組3個平行。實驗時，取對數生長期的扁藻，稀釋至105ind/mL分別置于100 mL的塑料瓶中(完全密封)，每瓶30只水蚤。黑暗環境下實驗24 h。為避免藻細胞沉降，每2 h晃動一次。實驗結束時，用魯哥試劑固定并用血球計數板在顯微鏡下統計細胞個數。計算公式如下：

其中：F為濾水率(mL·ind-1·h-1)；G為攝食率(cells·ind-1·h-1)；V為實驗溶液體積(mL)；N為每個平行水蚤個數(ind)；c0為起始餌料濃度(cells/mL)；ct為對照組餌料終濃度(cells/mL)；ctf為實驗組餌料終濃度(cells/mL)；t為實驗周期(h)[12]。

1.3.3 產糞粒數實驗 日本虎斑猛水蚤的馴化、饑餓及TBBPA濃度如上。實驗時，將日本虎斑猛水蚤挑至12孔板，每孔一只，每組24個成年橈足類個體，投喂青島大扁藻(105ind/mL)，分別在18、20、23 ℃下實驗24 h后用魯哥試劑固定并在解剖鏡下計產糞粒數[15]。

1.3.4 生物富集實驗 水蚤的馴化條件如上。實驗分別在18、20和23 ℃下進行，并且根據48 h-LC50值，設置溶劑對照組、1/100 LC50組、5/100 LC50組。每組十二個平行，每個平行30只水蚤。挑選孵化時間<24 h的無節幼蟲置于六孔板中，曝光條件如上，待發育至成體階段。挑選約12只掛卵雌體至12孔板中待其孵化，將剩余成年橈足類收集，并保存于-80 ℃冰箱。待12孔板中的雌體孵化后，將F1代無節幼蟲置于六孔板中，實驗和曝光條件均與F0代一致。每24 h換水50%，記錄并挑出死亡個體[12,18,32]。

1.4 TBBPA含量的測定

1.4.1 分析條件 使用使用高效液相色譜儀(安捷倫1100)測定TBBPA含量。柱溫30 ℃，檢測波長209 nm，流動相為甲醇：去離子水=80∶20(v/v)，流速1 mL/min，進樣體積20 μL[22-23]。

1.4.2 質量控制 按照上述方法處理空白樣品，測定結果對樣品無影響，依次加入0.1、1、5、10、25和50 mg/L的標準溶液，每組溶液做3個平行，測定信噪比S/N>3時，方法檢出限是0.01 μg/mL，平均回收率為89.52%，相對標準偏差為9.3%。

1.5 生物富集因子

生物富集因子(Bioaccumulation Factor，BAF)的計算公式為:BAF=Corg/Cw，其中：Corg為生物體內TBBPA的濕重濃度(ng/kg)，Cw為海水溶解態TBBPA的濃度(ng/L)。

1.6 數據分析

運用Excel對數據進行初步統計處理。采用SPSS16.0對實驗數據作統計分析。

2 結果

2.1 TBBPA對日本虎斑猛水蚤的48 h-LC50

實驗結果經SPSS16.0線性分析后，得出TBBPA對日本虎斑猛水蚤的48 h-LC50是4.423 mg/L。

2.2 不同溫度下TBBPA對日本虎斑猛水蚤攝食率和濾水率的影響

毒性暴露24 h后，比較TBBPA濃度對攝食率和濾水率的影響。18 ℃下(見圖1A)，攝食率和濾水率隨濃度升高而升高，97、221和487 μg/L均顯著高于對照組(p<0.05)。20 ℃下(見圖1B)，在一定濃度范圍內，水蚤的攝食率和濾水率呈現先升高(p>0.05)后顯著降低的變化趨勢(p<0.05)，在44 μg/L濃度下，攝食率和濾水率最高，分別為8 377.2 cells·ind-1·h-1和0.268 mL·ind-1·h-1；在97 μg/L的濃度下，攝食率最低，為7 583.9 cells·ind-1·h-1。23 ℃下(見圖1C)，隨著TBBPA濃度的升高，攝食率和濾水率呈現先降低(p>0.05)后增加再降低的趨勢(p<0.05)，在221 μg/L濃度下，攝食率和濾水率達到最大，分別是7 324.8 cells·ind-1·h-1和0.221 mL·ind-1·h-1(見圖1)。

比較溫度對攝食率和濾水率的影響。在20 ℃時，兩者達到最高(除221 μg/L濃度組的濾水率外)；18 ℃時最低，顯著(p<0.05)低于20和23 ℃；487 μg/L濃度下各溫度攝食組無顯著差異(P>0.05)。20和23 ℃的攝食率和濾水率只在44 μg/L的濃度組中差異顯著(P<0.05)(見圖2)。

(A、B、C分別表示18、20、23 ℃；不同字母表示p<0.05，顯著相關。相同字母表示p>0.05，不相關。A,B and C mean 18,20 and 23 ℃, respectively. The different letter meansp<0.05, significant correlation; The same letter meansp>0.05, uncorrelated.)

圖1 不同TBBPA濃度下日本虎斑猛水蚤的攝食率和濾水率
Fig.1 Feeding rate and filtration rate ofTigriopusjaponicusunder different concentration of TBBPA

(A、B分別表示攝食率和濾水率；不同字母表示p<0.05，顯著相關；相同字母表示p>0.05，不相關。A and B mean feeding rate and filtration rate, respectively.The different letter meansp<0.05, significant correlation; The same letter meansp>0.05, uncorrelated.)

圖2 不同溫度下日本虎斑猛水蚤的攝食率和濾水率
Fig.2 Feeding rate and filtration rate ofT.japonicusunder different temperature

2.3 不同溫度下TBBPA對日本虎斑猛水蚤產糞粒數的影響

TBBPA暴露24 h后，不同溫度下日本虎斑猛水蚤的產糞粒數如圖3。18 ℃下，產糞粒數只在高濃度組(487 μg/L)顯著下降(p<0.05)，為15.8粒。20 ℃下，在所有實驗組中，產糞粒數呈現先增加后降低的趨勢，在44 μg/L濃度下有最大值，為28.3粒。23 ℃下，44、97、487 μg/L濃度組均與對照組差異顯著(p<0.05)。

產糞粒數隨溫度的升高而升高。18 ℃組顯著低于20、23 ℃組。44 μg/L濃度組在20和23 ℃之間無顯著差異。97、221和487 μg/L濃度組中，23 ℃組顯著高于20 ℃組(p<0.05)。

2.4 不同溫度下TBBPA對日本虎斑猛水蚤兩世代富集的影響

2.4.1 日本虎斑猛水蚤體內富集的TBBPA濃度 TBBPA暴露兩世代后，F0代和F1代橈足類體內的TBBPA濃度都隨著溶液濃度的升高顯著增加。由于23 ℃的低濃度組數據丟失，所以之后的實驗未討論。在F0代(見圖4A)，44 μg/L的濃度下，20 ℃組水蚤體內TBBPA含量低于18 ℃組，僅為0.732 4 mg/g ww；220 μg/L濃度下，20 ℃組顯著低于其他溫度組，只有2.918 mg/g ww，23 ℃濃度值最大，為3.481 8 mg/g ww。在F1代(見圖4B)，44 μg/L濃度組在各溫度之間無顯著差異，但是220 μg/L濃度組，各溫度之間差異顯著(p<0.05)，在20 ℃最低，為3.027 mg/g ww；23 ℃最大，達到3.933 4 mg/g ww(見圖4)。

(不同字母表示p<0.05，顯著相關；相同字母表示p>0.05，不相關。The different letter meansp<0.05, significant correlation; The same letter meansp>0.05, uncorrelated.)

圖3 不同溫度和不同TBBPA濃度下日本虎斑猛水蚤的產糞粒數
Fig.3 Feces production ofT.japonicusunder different temperature and concentration of TBBPA

(A、B分別表示F0和F1代；不同字母表示p<0.05，顯著相關；相同字母表示p>0.05，不相關。A and B mean F0 and F1, respectively;The different letter meansp<0.05, significant correlation; The same letter meansp>0.05, uncorrelated.)

圖4 暴露在不同溫度和不同TBBPA濃度下日本虎斑猛水蚤體內富集的TBBPA濃度
Fig.4 Concentration of TBBPA ofT.japonicusexpose to various concentrations of TBBPA under different temperature

日本虎斑猛水蚤兩世代共同積累TBBPA的濃度如圖5，與F0代相比，F1代均有不同程度的增加。在44 μg/L濃度組中，F1代水蚤體內的TBBPA含量顯著高于F0代，18 ℃組和20 ℃組分別增加了20 %和40 %以上。在220 μg/L濃度組中，18 ℃和23 ℃組都增加了10 %以上。兩世代共同積累的TBBPA含量相比，只有220 μg/L濃度組在各溫度間差異顯著(p<0.05)，其中23 ℃下的220 μg/L濃度組最大，達到了7.414 4 mg/g ww。20 ℃下的44 μg/L濃度組最小為1.813 8 mg/g ww。

2.4.2 BAF的變化 毒性暴露兩世代后，在F0代(見圖6A)，44 μg/L濃度組中，18 ℃組的BAF最大，為19.89×103，20 ℃組較低；220 μg/L濃度組中，所有溫度組的BAF均小于44 μg/L濃度組，其中20 ℃組最小，為13.26×103。在F1代(見圖6B)，44 μg/L濃度組的BAF增加至持平，220 μg/L濃度組與F0代分布值一致(見圖6)。

毒性暴露兩世代后，F1代的BAF高于F0代，在44 μg/L濃度組中增加尤其顯著。在44 μg/L濃度組中，20 ℃組的BAF增加較快，在F1代已經超過18 ℃組。而在220 μg/L濃度組中，F0和F1兩個世代中均是23 ℃組的BAF最高，分別是15.83×103和17.88×103，20 ℃組最低，分別為13.26×103和13.76×103(見圖7)。

(純色表示F0代；星點表示F1代。Pore color means F0； Star means F1.)

圖5 暴露在不同溫度和不同TBBPA濃度下日本虎斑猛水蚤體內兩世代積累含量
Fig.5 Two generations of TBBPA concentration ofT.japonicusexpose to various concentrations of TBBPA under different temperature

(A、B分別表示F0和F1代。A and B mean F0 and F1, respectively.)圖6 暴露在不同溫度和不同TBBPA濃度下日本虎斑猛水蚤的生物富集因子Fig.6 BAF of T.japonicus expose to various concentrations of TBBPA under different temperature

(A、B分別表示44和220 μg/L。A and B mean 44 and 220 μg/L, respectively.)圖7 暴露在不同溫度和不同TBBPA濃度下日本虎斑猛水蚤的兩世代富集因子Fig.7 Two generations BAF of T.japonicus expose to various concentrations of TBBPA under different temperature

3 討論

3.1 日本虎斑猛水蚤的攝食率和濾水率

有報道稱，橈足類體內富含脂肪酸，在一定的暴露途徑中能夠富集某些化合物，從而產生不利的影響，如攝食活動紊亂、新陳代謝變化等[12]。本研究中，不同溫度下TBBPA對日本虎斑猛水蚤攝食率和濾水率的影響不同。常溫下的結果與徐風風等的結果基本一致，呈現這種結果可能是由于低濃度下水蚤因代謝消耗能量而輕微增加攝食，而高濃度的TBBPA則完全影響了水蚤的正常活動，致使水蚤產生了躲避行為從而減少攝食[24]。高溫條件下221 μg/L濃度組促進水蚤攝食，其他濃度組都不同程度的抑制了水蚤攝食，結合此濃度下的產糞粒數小而積累濃度卻大，這樣的結果正好與較大的攝食率和濾水率相對應。另外，劉麗華等發現PDBEs具有一定的神經毒性，而神經系統能夠在一定程度上調控橈足類的攝食活動[25]，所以TBBPA也可能會通過影響水蚤的神經系統而影響攝食和濾水。攝食率和濾水率在各溫度之間比較結果顯示，常溫>高溫>低溫(除221 μg/L濃度組的濾水率外)，本結果與薛澤等和李光福等的結果基本一致[15,26]。溫度是影響橈足類攝食的主要因素之一，隨著溫度的升高，橈足類代謝增強，所需能量增加，攝食率和濾水率也增加，但是當溫度超過其最適值之后，代謝就會受到抑制，攝食率和濾水率也會下降[27]。Changling Li等也指出橈足類的攝食率和濾水率隨著溫度的升高而升高[28]。

3.2 日本虎斑猛水蚤的產糞粒數

糞?？梢栽谝欢ǔ潭壬戏磻獦镒泐惻懦鑫廴疚锏臐舛取１狙芯恐腥毡净呙退榈?4 h產糞粒數隨著濃度的升高呈現先升高后降低的趨勢，在各溫度間則呈現逐漸升高的趨勢，而李光福等的研究中隨著溫度增加，產糞顆粒先增加后減少[15]，結果稍有不同，可能是本次研究溫度設置范圍較小的原因，沒有包括水蚤的最適產糞粒溫度。而在TBBPA影響下各濃度組表現出了不同的抑制或促進現象，在低濃度組(44 μg/L)中，日本虎斑猛水蚤的攝食率和濾水率更高，但是體內積累的TBBPA含量卻少，我們猜測這樣的結果是由于水蚤較高的產糞粒數造成的，而高濃度組(487 μg/L)相反的結果也能在一定程度上驗證我們的猜測。產糞粒數的變化側面反映了溫度和TBBPA對水蚤攝食和消化代謝的影響，有助于分析水蚤對污染物的積累情況，更有利于水蚤的生長繁殖。

3.3 日本虎斑猛水蚤體內的TBBPA濃度

TBBPA具有高親脂性、低水溶性的特點，易于在沉積物、生物體中積累[29]，浮游動物等小型水生生物極易受到影響，一旦它們在體內富集，污染物就會沿著食物鏈和食物網傳遞，對高營養級生物造成毒性效應[29-30]。本研究中，日本虎斑猛水蚤體內的TBBPA濃度隨著溶液濃度的升高顯著增加，這是因為水體中的TBBPA會通過橈足類攝食等途徑進入體內[31]。江田田等也曾指出浮游動物體內TBBPA的濃度與海水濃度變化相一致。另外，生物體可以通過產卵等方式將污染物傳遞給后代[32]，因此后代就具有相對較大的基數，當后代處于同樣的環境中時，富集的污染物量勢必高于親代，這與本研究中的結論一致。在兩個濃度組的兩世代增加比例來看，低濃度的TBBPA在橈足類中具有更大的增加比率。鞏文靜等人的研究也表明，TBBPA在指狀偽鏢水蚤中具有傳代積累毒性[12]。

TBBPA富集量在各溫度之間的比較顯示，高溫(23℃)>低溫(18℃)>常溫(20℃)，這可能是由于不同的吸收消化效率造成的[32]。結合攝食率、濾水率和產糞顆粒的結果，水蚤在常溫下具有最高的攝食率和濾水率，而產糞顆粒卻不是最高，富集量最小，這是因為水蚤的糞便是由餌料代謝產生的[24]，本次研究投喂的餌料未染毒，通過濾水攝入體內的TBBPA有一部分隨糞便排出，出現常溫組富集量最小的現象。而一定范圍內的低溫和高溫，都會增加TBBPA在水蚤體內積累的幾率[15]。Siriporn等也曾指出溫度會影響BPA在生物體內的積累[33]。

3.4 生物富集因子(BAF)

生物富集因子(BAF)代表生物體對污染物的富集能力。江田田等人測定夏冬兩季渤、黃海浮游動物對TBBPA的富集因子平均值分別為14.396×103和14.839×103，logBAF范圍分別是3.26～4.80和3.07～4.59[32]。本研究結果在其范圍內，表明日本虎斑猛水蚤對TBBPA具有較強的生物富集性(BAF>5 000)。隨著世代的增加，BAF也增加，且低濃度組增幅較大。本研究還發現，隨著日本虎斑猛水蚤體內TBBPA濃度的增加，BAF顯著增加，但是當溶液中TBBPA濃度增加時，BAF卻降低，這樣的結論與江田田和李學鵬的結論一致。李學鵬等還指出影響BAF的因素主要包括溫度等環境因素和生物量等生物因素[34]，本次研究結果也證明了這一觀點。

綜上所述，在溫度的作用下，TBBPA對日本虎斑猛水蚤的攝食、產糞以及富集都有不同程度的影響。低濃度的TBBPA能夠促進攝食與產糞，并且隨溫度升高而增加。在日本虎斑猛水蚤富集TBBPA方面，BAF偏高，水蚤體內的富集量隨溶液濃度的升高而增加，并且具有明顯的世代效應；當改變溫度時，富集量和BAF也發生一定程度的變化。因此在水體污染日漸嚴重和氣溫逐漸增加的當前環境中，研究以日本虎斑猛水蚤為代表的橈足類的富集情況，可以為評估海洋生物富集能力提供依據，有利于水生生態系統的健康發展。