左金丸對二甲基苯蒽/巴豆油誘導小鼠皮膚腫瘤的預防作用

楊 寰，杜金城，杜鋼軍

(1. 開封市中醫院藥劑科，河南 開封 475001； 2. 湖南中醫藥大學，長沙 410208；3. 河南大學藥學院，河南 開封 475004)

皮膚腫瘤是發生于身體暴露部位惡性腫瘤的統稱，系表皮角質形成細胞惡性增生的結果[1]，產生的病因目前尚不清楚。左金丸源于《丹溪心法》，由黃連和吳茱萸按6∶1組成，有清肝瀉火、降逆止嘔的功效[2]。現代藥理研究表明，其對胃癌、乳腺癌、大腸癌等均有防治作用[3-5]，但對皮膚腫瘤是否具有防治作用尚未有報道。動物模型是腫瘤相關研究的重要工具，本研究采用與人體皮膚腫瘤發病機制相似的DMBA/TPA二階段小鼠皮膚腫瘤模型，觀察左金丸對皮膚癌的預防作用，為左金丸防治皮膚腫瘤提供實驗依據。

1 材料

1.1 實驗動物

昆明雌性小鼠，體質量20～24 g，購于河南省醫學實驗動物中心 (動物生產許可證SCXK(豫)2015-0002)。

1.2 藥品及試劑

左金丸按原方中所含中藥黃連和吳茱萸6∶1的比例稱取中藥配方顆粒(黃連、吳茱萸均購開封天濟堂大藥房，由開封市中醫院藥劑科中藥室楊寰主管藥師鑒定為正品，并制備為配方顆粒。配方顆粒劑中黃連、吳茱萸顆粒劑為 1 g相當于飲片5 g)組成，用時按需要用生理鹽水溶成所需溶液。二甲基苯蒽(批號160839)、巴豆油(批號160218)、多聚甲醛(批號160423)和蘇木精(批號150622)購自美國 sigma 公司；PCNA、E-cadherin、N-cadherin、HRP-羊抗兔二抗(批號20160908)購自武漢三鷹生物技術有限公司；IL-1、IL-6、hs-CRP、TNF-α和AEC試劑盒(批號20160912)，購自美國安迪生物技術有限公司；AST、ALT和肌酐試劑盒(批號20160815)，購自南京建成生物工程研究所；免疫組化試劑盒(批號20160910)，購自武漢博士德生物工程有限公司，其余試劑均為市售分析純。

1.3 實驗器材

FA1004 N型電子天平，上海精密儀器有限公司；YLA-1 A型多功能小鼠自主活動儀，淮北正華生物儀器設備有限公司；XFA6130全自動動物血液細胞分析儀，南京普朗醫療設備有限公司；ELX-800UV型酶標儀，美國Bio-Tek公司；RM2235型轉輪式切片機，德國萊卡公司；BX43病理圖像分析系統，日本奧林巴斯公司。

2 方法

2.1 皮膚腫瘤模型建立與分組

昆明雌鼠用蒸餾水將背部的皮膚潤濕(2×2 cm 左右的面積)，取脫毛膏適量均勻涂抹在小鼠背部。5 min 之后，觀察到背毛已溶解時，輕輕用溫水擦掉殘留的脫毛膏和已溶解的背毛，然后用干毛巾將小鼠背部脫毛處擦干。將背部脫毛小鼠75只按隨機數字表法分為正常組、模型組和左金丸組，每組小鼠各25只。分組次日，模型組和左金丸組用75 mg/100 ml 的二甲基苯蒽丙酮液0.2 ml涂于小鼠背部脫毛處，每周1次，連涂3周。從第4 周開始，在小鼠背部二甲基苯蒽誘瘤部位涂0.25 ml/100 ml 的巴豆油丙酮液0.2 ml，每周 2 次，直到皮膚乳狀肉瘤數目保持2周不再增加，停止涂抹巴豆油，終結實驗。正常組與模型組平行僅涂相同容量的丙酮。

2.2 藥物預防

小鼠第1次涂二甲基苯蒽丙酮液后次日，左金丸組按人體等效劑量原藥材0.75 g/kg體質量將配方顆粒溶成0.75%的溶液，以0.2 ml/10 g體質量給小鼠灌胃，每日2次，每周給藥6 d。正常組和模型組平行灌胃等容量生理鹽水。

2.3 常規指標檢測

每日觀察小鼠活動、毛色是否正常，如有死亡解剖檢查原因。實驗結束前1周記錄飲食量，計算平均每只小鼠的周飲食量；實驗結束前2 d自主活動儀檢測自主活動，計算平均每只小鼠10 min內的活動次數；實驗結束后小鼠眼眶靜脈叢采血，血液細胞分析儀自動完成紅細胞、白細胞和血小板計數，并自動計算血紅蛋白含量，其中白細胞計數包含占白細胞比例較多的淋巴細胞和中性粒細胞計數；部分血清用試劑盒檢測AST、ALT和肌酐含量。

2.4 腫瘤相關指標檢測

記錄小鼠皮膚乳狀肉瘤肉眼可見出現時間及每只小鼠每周的皮膚乳狀肉瘤數目，待皮膚乳狀肉瘤數目穩定2周后終結實驗。各組小鼠計數皮膚乳狀肉瘤數目后眼眶靜脈采血分離血清，按試劑盒說明檢測IL-1、IL-6、hs-CRP和TNF-α含量。之后處死小鼠，取皮膚致瘤組織做免疫組化染色，分析皮膚組織中E-Cadherin、N-Cadherin和增殖標志PCNA表達強度，評價左金丸對小鼠皮膚腫瘤的預防效果。

免疫組化過程與評價方法如下： 將皮膚致瘤組織0.38%的多聚甲醛PBS中性溶液固定48 h后常規酒精梯度脫水、石蠟包埋，切成4 μm后的切片后貼附于防脫載玻片上，經常規脫蠟和水化后于3%H2O2溶液中室溫孵育10 min，消除內源性過氧化物酶的活性;將切片放入檸檬酸緩沖液微波煮沸5 min×2次修復抗原;5%BSA 室溫封閉20 min，傾去多余液體，滴加1∶50 稀釋的E-Cadherin、N-Cadherin和PCNA兔抗鼠多克隆抗體，4 ℃過夜;PBS洗3次后生物素化羊抗兔IgG，37 ℃孵育20 min;PBS沖洗3次后滴加 SABC，37 ℃ 孵育 20 min;PBS沖洗3次后AEC顯色劑顯色，蘇木素輕度復染核，封片后在光鏡下觀察。采用半定量方法表達結果，切片的染色強度記分:0分：染色為陰性;1分：染色為弱陽性(淺紅棕色);2分：染色為陽性(紅棕色); 3分：染色為強陽性(深紅棕色)。

2.5 統計學方法

3 結果

3.1 左金丸對小鼠常規指標的影響

表1顯示，與正常小鼠比較，模型組和左金丸組小鼠食量和自主活動均有減少趨勢(P>0.05)，白細胞、淋巴細胞和中性粒細胞數均明顯升高(P<0.05)，但模型組和左金丸組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。對其他代表肝功能的血清AST和ALT含量(P>0.05)，代表腎功能的血清肌酐含量(P>0.05)，代表血液毒性的血紅蛋白含量(P>0.05)、紅細胞和血小板數(P>0.05)進行常規指標檢測，正常組小鼠、模型組和左金丸組小鼠組間比較差異無統計學意義。

表1 左金丸對小鼠常規指標的影響

注：與模型組比較：*P<0.05

3.2 左金丸對小鼠皮膚腫瘤相關指標的影響

表2顯示，模型組和左金丸組小鼠到實驗終結時外觀和活動均無異常的小鼠有20只，模型組小鼠成瘤時間始于誘癌后第6周，第10周后腫瘤數量不再增加，20只小鼠全部出現皮膚腫瘤；左金丸組小鼠成瘤時間始于誘瘤后第8周, 第10周后腫瘤數量不再增加，20只小鼠中14只出現皮膚腫瘤，腫瘤發生率和平均每只小鼠致瘤數與模型組比較均有顯著減少(P<0.01)。與正常小鼠比較，模型組小鼠血清IL-1、IL-6、hs-CRP和TNF-α炎癥因子均明顯增高(P<0.01)；與模型組比較，左金丸對上述血清炎癥因子均有顯著降低作用(P<0.01)。

表2 左金丸對小鼠皮膚腫瘤相關指標的影響

注：與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01

表2圖1顯示，與正常組小鼠比較，模型組小鼠皮膚組織E-Cadherin明顯降低、N-Cadherin明顯升高，上皮-間充質轉化增強(P<0.01)，增殖標志物PCNA明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，左金丸對皮膚組織上皮-間充質轉化和增殖均有顯著降低作用(P<0.05)。

圖1 左金丸對小鼠皮膚組織上皮-間充質轉化和增殖的影響(免疫組化 ×200)

4 討論

皮膚腫瘤可能的因素有紫外光照射、長期不愈的慢性潰瘍、燒傷瘢痕等，一旦發生可向內臟轉移致死，目前尚無十分有效的治療藥物[6]。中藥具有未病先防的優勢，很明顯不論從花費還是從療效上都要優于發病后的治療。左金丸僅由黃連和吳茱萸2味藥組成，方中黃連苦寒、清熱燥濕、瀉火解毒，吳茱萸辛苦且熱、辛散溫通、溫肝暖腎，兩藥寒熱配對，共奏清瀉肝火、降逆和胃、開郁散結之功。中醫學認為,皮膚腫瘤是內有痰濁、外有火毒、風毒相搏、氣滯血瘀等致病因素引起[7]。本研究結果表明，左金丸按人體等效劑量給藥對二甲基苯蒽/巴豆油誘導小鼠皮膚腫瘤不僅減少腫瘤數目，也降低致腫瘤小鼠數量，為其用于防治皮膚腫瘤提供了實驗依據，也符合中藥重視清除毒邪、消除腫瘤因毒而生病因的防治原則[8]。

目前研究顯示，黃連-吳茱萸藥對主要功效物質基礎為生物堿類成分，黃連中的黃連素和吳茱萸的吳茱萸堿對多種腫瘤細胞有直接生長抑制作用[9-10]，應該是左金丸防治腫瘤的物質基礎。龔夢鵑等對左金丸血清藥物化學進行初步研究，口服左金丸水煎液后在大鼠血清中發現14個入血成分，其中5個為原型成分，9個為代謝產物[11]。腫瘤發生不論外因主導還是內源性機制，致病因素持續存在引起的持續性炎癥損傷和修復決定了腫瘤以 “慢性炎癥”為特征的病理特點[12]。本研究結果表明，左金丸對皮膚腫瘤小鼠血清IL-1、IL-6、hs-CRP和TNF-α炎癥因子均有顯著降低作用，體現了左金丸改善機體炎性微環境預防皮膚腫瘤的中醫整體觀，也隱含了皮膚腫瘤像其他腫瘤一樣的系統炎癥發病機制。

雖然腫瘤發生的機制尚不清楚，但皮膚組織上皮-間充質轉化和增殖是腫瘤發生的基礎[13]。本研究結果表明，左金丸對皮膚組織上皮-間充質轉化和增殖均有顯著降低作用。結合左金丸不引起傳統化療藥物一樣的系統毒性，從安全性和經濟成本上均比腫瘤化學防治藥有明顯優勢，加之其既能使肝火清而自不橫逆犯胃、使胃火清的同時清降胃氣，體現了中藥治病“祛邪不忘保胃氣、調養之中護胃氣”的腫瘤防治思想[14]，有望成為一個防治腫瘤的物美價廉良藥。