秦皮對去卵巢所致大鼠骨質疏松癥的治療作用及機理探討?

劉梅潔，鞠大宏，王瑞海，孫 剛，潘靜華，李 艷，劉 紅，王少君，苗 青，許 京，劉麗梅△

(1. 中國中醫科學院醫學實驗中心，中醫藥防治重大疾病基礎研究北京市重點實驗室，北京 100700；2. 中國中醫科學院中醫基礎理論研究所, 中醫方證基礎研究中心， 北京 100700)

秦皮是傳統中藥材，《神農本草經》記載秦皮“主風寒濕痹”。骨質疏松癥屬于中醫骨痹、骨痿范疇。本研究采用經典的去卵巢所致骨質疏松癥模型，對秦皮治療骨質疏松癥的作用進行了初步評價，以期為進一步深入研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 動物

選用健康雌性SPF級SD大鼠40只，體質量(200±20) g，由中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供(許可證編號SCXK-(軍)2012-0004)，在中國中醫科學院中醫基礎理論研究所清潔級實驗動物室飼養(實驗動物室許可證號SYXK(京)2010-0032)。

1.2 藥物

秦皮藥液：秦皮飲片3 kg，按優選工藝(加9倍量水，煎煮3次，每次1.5 h)藥液合并，減壓回收溶劑，濃縮至0.67 g生藥/ ml。

1.3 試劑

戊巴比妥鈉，德國MERCK公司(批號20131206)；鹽酸四環素，北京索萊寶科技有限公司(批號1104B047)；甲基丙烯酸甲酯，天津市福晨化學試劑廠(批號20140427)；甲基丙烯酸丁酯，天津市福晨化學試劑廠(批號20130417)；聚乙二醇400，天津市福晨化學試劑廠(批號20110527)；苯甲酸甲酯，國藥集團化學試劑有限公司(批號20120627)；過氧化苯甲酰，北京益利精細化學品有限公司(批號20040610)；N,N-二甲基對甲苯胺(N,N-Dimethyl-p-toluidine)，美國Sigma公司(批號04327 MB-235)；OPG抗體，美國Abcam公司(批號GR187782-2)；RANKL抗體，美國Abcam公司(批號GR10701-10)。

1.4 儀器

2040切片機,德國Reicheit-Jung公司;FINESSE ME+全自動石蠟切片機;美國Thermo公司;Pannoramic MIDI組織切片掃描儀;匈牙利3D HISTECH公司；Pannoramic viewer與Quant center圖像分析軟件，匈牙利3D HISTECH公司。

1.5 分組及處理

選用健康雌性SD大鼠40只，按隨機數字表法分為空白對照組10只、假手術組10只、造模組各20只。所有大鼠適應性喂養1周后，將造模組大鼠以45 mg/kg劑量的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，腹位固定行雙側卵巢切除術[1]。假手術組處理方法同造模組，但只切除小塊脂肪組織不摘除卵巢。術后10 d，將造模組大鼠按隨機數字表法分為模型組和秦皮組各10只。隨后秦皮組大鼠給予秦皮水煎液(0.67 g生藥/kg·d)每日1次，連續6 d，休息1 d，再連續給藥6 d，如此給藥3個月。空白對照組、假手術組和模型組按同法灌服等體積純凈水。

各組大鼠于處死前16 d和前3 d分別腹腔注射鹽酸四環素30 mg/kg體質量，并對骨組織進行熒光標記[2]。給藥結束后將大鼠處死，取左側脛骨制作不脫鈣骨切片，用于骨組織形態計量學指標的檢測；取右側脛骨制作大鼠脛骨脫鈣骨的石蠟切片，用于檢測大鼠脛骨骨髓中OPG和RANKL 的蛋白表達。

1.6 指標檢測

骨組織形態計量學指標測定[3]：分別檢測骨小梁體積百分比(TBV%)、骨小梁吸收表面百分比(TRS%)、骨小梁形成表面百分比(TFS%)、骨小梁礦化率(MAR)和類皮質平均寬度(OSW)。大鼠脛骨骨髓中OPG和RANKL的蛋白表達檢測：采用免疫組化法分別檢測脛骨骨髓中OPG和RANKL蛋白表達。圖片經Pannoramic MIDI組織切片掃描儀掃描完成后，采用Quant center中的densito quant軟件自動識別并設置組織切片上所有的深棕色為強陽性，棕黃色為中度陽性，淺黃色為弱陽性，藍色細胞核為陰性。進而對每個組織進行識別分析出強陽性、中度陽性、弱陽性及陰性的面積(像素)和陽性的百分比，最后進行H-score評分。H-SCORE 即 histochemistry score(組織化學評分)的縮寫，是處理免疫組化結果的一種組織學評分方法，將每張切片內陽性的細胞數量及其染色強度轉化為相應的數值，達到對組織染色半定量的目的。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 秦皮對卵巢切除大鼠脛骨骨組織形態計量學指標的影響

表1圖1顯示，模型組大鼠脛骨TBV%顯著低于假手術組，TRS%、TFS%、OSW和MAR均明顯高于假手術組。與模型組比較，秦皮組大鼠脛骨TBV%明顯增高，但仍顯著低于假手術組；TRS%、TFS%、OSW和MAR均明顯降低。

表1 各組大鼠脛骨骨組織形態計量學指標變化比較

注：與假手術組比較:*P<0.05,**P<0.01；與模型組比較:△P<0.05，△△P<0.01

圖1 各組大鼠脛骨骨小梁分布情況(甲苯胺藍染色 ×5)

2.2 秦皮對卵巢切除大鼠脛骨骨髓中OPG、RANKL蛋白表達的影響

表2圖2、3顯示，與假手術組比較，模型組大鼠脛骨骨髓中OPG蛋白表達綜合評分顯著降低，而RANKL蛋白表達綜合評分顯著增高；秦皮組大鼠OPG蛋白表達綜合評分顯著高于模型組，而RANKL蛋白表達綜合評分顯著低于模型組，與假手術組比較仍有明顯差異。

表2 各組大鼠OPG、RANKL蛋白表達變化比較

注：與假手術組比較:*P<0.05,**P<0.01；與模型組比較:△△P<0.01

與空白對照組比較，假手術組上述各項指標均無顯著差異，從而排除了手術因素對實驗的影響。

圖2 各組大鼠脛骨骨髓中OPG蛋白表達比較(免疫組化染色 ×10)

圖3 各組大鼠脛骨骨髓中RANKL蛋白表達比較

3 討論

秦皮為傳統中藥材，在臨床主要用于治療細菌性痢疾等炎癥性疾病[4-5]。《神農本草經》記載，秦皮“主風寒濕痹”。有研究表明，中藥秦皮能明顯降低骨關節炎關節液中的前列腺素E2(PGE2)水平[6]，而PGE2可激活破骨細胞，有很強的促進骨吸收作用。這一研究也提示，秦皮可能通過抑制PGE2水平而對骨質疏松癥的防治產生影響。秦皮乙素是秦皮的主要化學成分之一，研究發現，秦皮乙素在50～100 mg/kg劑量下在體內表現出雌激素效果，秦皮乙素的弱雌激素樣作用可在絕經后的治療中發揮作用[7]；而雌激素可有效控制破骨細胞的骨吸收作用，其水平下降可導致骨質疏松癥的發生。Yamada等報道，秦皮乙素通過抑制基質金屬蛋白酶proMMP-1和proMMP-3合成、分泌及其活性，用于治療骨關節炎和風濕關節炎造成的軟骨損傷[8]；而基質金屬蛋白酶(MMP)參與骨的重塑和構建，且表達骨吸收活性。秦皮素亦是秦皮的主要化學成分。Kuo等利用人成骨細胞MG-63細胞研究表明，在秦皮素介導的成骨細胞成熟和分化過程中，是通過促進骨形態發生蛋白-2和4(BMP-2、BMP-4)的產生來影響其分化過程[9-10]。綜合上述研究結果我們推測，秦皮藥材在治療細菌性痢疾和骨關節炎等炎癥性疾病之外，對于骨質疏松癥亦有一定的防治作用。

本研究表明，切除大鼠卵巢3個月后，與假手術組比較，模型組衡量骨量水平的TBV%顯著降低，而反映骨吸收情況的TRS%以及反映骨形成情況的TFS%、MAR和OSW則明顯增加，表明切除卵巢所造成的是一種骨吸收大于骨形成的高轉換型骨質疏松癥動物模型，這與絕經后骨質疏松癥的病理特點相一致[11-12]。給藥3個月后，秦皮組的TBV%較模型組明顯增加，與模型組比較，秦皮組的TRS%、TFS%、MAR和OSW均顯著降低。這一結果表明，該劑量的秦皮藥液對去卵巢所致的大鼠骨質疏松癥具有一定的治療作用，其對骨形成和骨吸收環節均有一定的調節作用。

RANKL是能夠直接刺激破骨細胞發育并使之激活的惟一細胞因子，它與破骨細胞表面的RANK相結合，強有力地促進破骨細胞的生成、分化、成熟，并能增強破骨細胞運動能力，同時還可以抑制破骨細胞的凋亡，延長其存活時間[13]。而OPG又稱為骨保護素，它可以通過與RANKL的結合，抑制破骨細胞的分化成熟，從而抑制骨吸收，減少骨量的丟失。因此，OPG/RANKL通路是非常重要的破骨細胞分化調節信號通路。本實驗結果顯示，模型組大鼠脛骨骨髓腔內OPG蛋白表達顯著降低，而RANKL蛋白表達顯著增加，這應該是模型組大鼠骨量丟失的機理之一。而秦皮藥液后，大鼠的OPG和RANKL的蛋白表達均有不同程度的逆轉，這說明該劑量的秦皮對OPG/RANKL破骨細胞分化通路有一定的調節作用，可以促進OPG蛋白的分泌而抑制RANKL蛋白的分泌，從而對骨代謝有一定的調節作用。綜合上述實驗結果可以看出，秦皮對去卵巢所致的骨質疏松癥有較為明顯的治療作用。其作用途徑是對OPG/RANKL破骨細胞分化通路進行調節，促進OPG蛋白的表達而抑制RANKL蛋白的表達，從而抑制過度增強的破骨細胞活性，降低卵巢切除所導致過高的骨轉換率，進而防止骨量的快速丟失。