異煙肼、利福平聯(lián)合應用對體外培養(yǎng)成骨細胞生物活性的影響

馬永海 鞏棟 王偉 邵隴龍 甄平

1.寧夏醫(yī)科大學，寧夏 銀川 750000 2.甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000 3.解放軍蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院骨科，甘肅 蘭州 730050

在過去20年中，特別是發(fā)展中國家，隨著多藥耐藥結核菌株的出現(xiàn)及艾滋病患者的增加，骨關節(jié)結核發(fā)病率呈上升趨勢。骨結核病灶手術清除后給予抗結核治療是治療骨結核的基本方法。目前病灶清除術后通過口服或局部用藥方式抗結核。由于病灶區(qū)慢性炎癥導致纖維結體組織形成，局部血運差，口服用藥難以在病灶區(qū)內(nèi)達到有效的殺菌濃度，當機體免疫功能下降時容易導致結核復發(fā)，同時抗結核藥物治療的周期長，毒副作用較為明顯，患者很難堅持每天服藥[1-2]。近十年來，許多研究人員和臨床醫(yī)師嘗試局部用藥，提高抗癆療效[1, 3]。但是清創(chuàng)術后采用緩釋體治療骨結核是否影響骨愈合，以及將緩釋的濃度控制在什么范圍，既能達到有效殺菌濃度又不影響病灶骨愈合等問題，值得探討和研究。異煙肼(isoniazid， INH)和利福平(rifampin，RFP)均有較強抗菌作用，且兩藥聯(lián)用有協(xié)同作用。本研究將針對不同濃度抗結核藥物INH和RFP聯(lián)合應用對大鼠成骨細胞(osteoblasts，OB)的增殖、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性、I型膠原蛋白表達和OB成熟與礦化能力的影響進行探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

新生(出生24 h內(nèi))清潔級SD乳鼠5只，雌雄不限，由蘭州軍區(qū)總醫(yī)院動物中心提供。

1.2 實驗試劑

異煙肼原藥(Sigma公司，純度>99%)；利福平原藥(Sigma公司，純度>99%)；胎牛血清(蘭州榮曄生物公司)；α-MEM培養(yǎng)基(Gibco公司)；胰蛋白酶(Sigma公司)；Ⅱ型膠原酶(Sigma公司)；免疫熒光二抗羊抗兔(KPL)、一抗兔抗鼠(Abcam公司)；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(北京索萊寶)；牛血清蛋白、磷酸鹽緩沖液、CellCountingKit-8(日本同仁)、TritonX-100(上海碧云天公司)、PBS(上海碧云天公司)；堿性磷酸酶活性測試盒(南京建成公司)。

1.3 方法

1.3.1成骨細胞分離培養(yǎng)：取5只新生SD大鼠處死后浸泡于75%的乙醇中15 min，在無菌條件下取其顱骨并去除結締組織，PBS漂洗3次。將顱骨剪成約1 mm×1 mm大小的碎片，轉移至培養(yǎng)瓶中，加入0.25%胰蛋白酶2～3 mL，37 ℃預消化10 min，棄消化液后重復1次。換0.1%Ⅱ型膠原酶消化10 min，棄上清；再用0.1%Ⅱ型膠原酶消化3次，37 ℃每次消化20 min，收集并合并消化液，200目細胞篩過濾3次，濾液1 000 r/min，離心5 min，棄上清，加入含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液懸浮，吹打均勻并計數(shù)，調(diào)整細胞濃度至3×104個細胞/mL，在飽和濕度、5%CO2、37 ℃的條件下培養(yǎng)，每隔3 d換液1次，鏡下觀察當細胞鋪滿皿底80%后，用胰蛋白酶消化傳代。

1.3.2藥物處理：成骨細胞采用含10%胎牛血清(FBS)的α-MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，37 ℃、5% CO2。實驗開始24 h前將細胞用PBS洗滌后換用無血清α-MEM培養(yǎng)基饑餓處理。分為對照組和實驗組，實驗組分別加入不同濃度的INH+RFP [(10+3)μg/mL、(20+6) μg/mL、(30+12) μg/mL、(40+24) μg/mL、(50+48) μg/mL)]。INH和RFP用二甲基甲酰胺(EDMF)溶解后，用培養(yǎng)液稀釋成所需濃度。(1)不同濃度INH、RFP對成骨細胞細胞增殖的影響。取第3代成骨細胞，用含0.02%四乙酸乙二胺(EDTA)的0.25%胰酶消化，制成DMEM細胞懸液，以5×104/孔接種于48孔板中。48孔板隨機設對照組和實驗組，每組設5個重復孔，培養(yǎng)24 h后待細胞貼壁后去除培養(yǎng)液，對照組加入不含藥物的含20%胎牛血清的H-DMEM培養(yǎng)液1 000 μL，實驗組分別加入不同濃度INH+RFP的含20%胎牛血清的H-DMEM培養(yǎng)液1 000 μL置于5%CO2的培養(yǎng)箱中，分別培養(yǎng)24 h后取出48孔板，每孔加入CCK-8 10 μL繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)0.5 h后分別用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度，然后選取吸光度比較適宜的時間點作為后續(xù)試驗時間點。(2)不同濃度INH+RFP對成骨細胞ALP活性的影響。將P1代細胞以5×104/孔接種于48孔板中，共2板，48孔板隨機設對照組和實驗組。對照組加入不含藥物的含20%胎牛血清的H-DMEM培養(yǎng)液1 000 μL，實驗組分別加入不同濃度INH+RFP的含20%胎牛血清的H-DMEM培養(yǎng)液1 000 μL，置于5% CO2培養(yǎng)箱中，每組設5個重復孔，培養(yǎng)3 d和6 d后檢測細胞內(nèi)ALP活性，采用ALP活性測定試劑盒檢測。實驗步驟如下：棄培養(yǎng)液，PBS漂洗3次，每孔加入緩沖液和基質(zhì)液各0.25 mL，混勻，37 ℃水浴15 min后，加入0.75 mL顯色液，在520 nm波長下測定酚標準及樣本的吸光值。(3)不同濃度INH、RFP對成骨細胞Ⅰ型膠原的表達。將P1代細胞以1×105進行爬片培養(yǎng)，12 h后隨機設對照組和實驗組。對照組加入不含藥物的含20%胎牛血清的H-DMEM培養(yǎng)液1 000 μL，實驗組分別加入不同濃度INH+RFP的含20%胎牛血清的H-DMEM培養(yǎng)液1 000 μL，置于5% CO2培養(yǎng)箱中，24 h后取出爬片并用PBS漂洗2次，4%的多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗3次后用0.5% Triton-X100透膜20 min。PBS漂洗3次后滴加免疫熒光封閉液室溫封閉1 h，勿洗，滴加Ⅰ型膠原抗體 (1∶500)并4 ℃過夜，次日PBS漂洗3次，每次3 min，之后滴加免疫熒光二抗(1∶1000)，37 ℃孵育1 h，PBS漂洗3次，每次3 min，抗熒光封片液封片，熒光顯微鏡觀察不同組間細胞中Ⅰ型膠原表達的情況。Image-Pro Plus 6.0軟件掃描測定灰度值。(4)茜素紅鈣化結節(jié)染色。將傳代后的細胞接種在35 mm培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿隨機設對照組和實驗組，對照組加入不含藥物的含20%胎牛血清的H-DMEM培養(yǎng)液1 000 μL，實驗組分別加入不同濃度INH+RFP的含20%胎牛血清的H-DMEM培養(yǎng)液1 000 μL，置于5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，對其進行染色。具體方法如下：棄培養(yǎng)液，PBS漂洗2遍，加入4%多聚甲醛溶液固定10 min，棄固定液，加入pH 值為8.9、0.1%的茜素紅染色液，37 ℃水浴45 min，蒸餾水清洗，換固定液照相記錄結果。同時采用Image-Pro Plus 6.0軟件掃描鈣化結節(jié)的面積、數(shù)量和灰度，并進行統(tǒng)計學分析。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 不同濃度INH+RFP對成骨細胞細胞增殖的影響

如圖1所示，INH、RFP聯(lián)合作用于大鼠成骨細胞24 h后，(10+3) μg/mL組與對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，其他實驗組細胞活性顯著低于對

照組(P<0.05)。結果表明，INH、RFP聯(lián)合濃度為(20+6) μg/mL即可抑制成骨細胞增殖，抑制作用隨著濃度的增加而增強。

圖1 各組大鼠成骨細胞CCK8定量結果(與對照組比較，*P<0.05)Fig.1 CCK8 quantitative results of rat osteoblasts in each group (compared with the control group,*P<0.05)

2.2 不同濃度INH、RFP對成骨細胞ALP活性的影響

INH、RFP聯(lián)合作用于成骨細胞3 d、6 d后檢測細胞的ALP活性，如圖2所示。3 d和6 d (10+3) μg/mL組的ALP活性與對照組差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其余各實驗組都顯著低于對照組(P<0.05)。實驗結果表明，INH、RFP聯(lián)合濃度為(20+6) μg/mL即可降低ALP活性，且隨著濃度增加ALP活性會降低更多。

圖2 A：藥物處理3 d時的ALP活性定量結果；B：藥物處理6 d時的ALP活性定量結果Fig.2 A: ALP activity quantitative results at 3 days of drug treatment; B: ALP activity quantitative results at 6 days of drug treatment注：與對照組比較，*P<0.05。

2.3 不同濃度INH、RFP對成骨細胞Ⅰ型膠原表達的影響

如圖3所示，細胞漿中紅色熒光隨著藥物濃度的增加，熒光越來越弱。(10+3) μg/mL組與對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，其他實驗組成骨細胞Ⅰ型膠原相對表達量顯著低于對照組(P<0.05)。結果表明，INH、RFP聯(lián)合濃度為(20+6) μg/mL即可抑制成骨細胞增殖，抑制作用隨著濃度的增加而增強。

圖3 不同濃度INH+RFP對成骨細胞I型膠原表達結果。A：顯微鏡下觀(100×)；B：定量結果Fig.3 Effect of different concentrations of INH+RFP on the expression of type I collagen of osteoblast. A: Microscopes (100×), B: Quantitative results注：與對照組比較， *P<0.05。

2.4 茜素紅鈣化結節(jié)染色

如圖4及表1所示，隨著藥物濃度的增加，鈣化結節(jié)的面積、數(shù)量和灰度越來越小。(10+3) μg/mL組與對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，其他實驗

組鈣化結節(jié)的面積、數(shù)量和灰度顯著低于對照組(P<0.05)。結果表明，INH、RFP聯(lián)合濃度為(20+6) μg/mL即可抑制成骨細胞增殖，抑制作用隨著濃度的增加而增強。

表1 不同濃度INH+RFP對成骨細胞鈣化結節(jié)形成能力的影響 Table 1 Effects of different concentrations of INH+RFP on the formation of calcified nodules in osteoblasts s，n=3)

注：與對照組比較，*P<0.05。

圖4 A：14 d時成骨細胞鈣化結節(jié)染色結果；B：顯微鏡下觀(40×)Fig.4 A: Colonization results of calcified nodules in osteoblast at 14 days; B: Microscopes (40×)

3 討論

骨關節(jié)結核是一種古老的疾病，在埃及木乃伊[4]和亞洲鐵器時代的遺骸[5]中通過組織學和聚合酶鏈反應[6]發(fā)現(xiàn)骨關節(jié)結核的證據(jù)。骨關節(jié)結核是一種嚴重的傳染病。由于結核菌在局部病灶內(nèi)繁殖可造成骨質(zhì)明顯的破壞并產(chǎn)生大量的壞死組織，未及時治療或治療不規(guī)范，隨著病情的進展常引起骨與關節(jié)結構和功能嚴重受損。骨關節(jié)結核治療目的是清除結核病灶并阻止病灶擴散，預防因骨質(zhì)破壞而出現(xiàn)的畸形及神經(jīng)功能障礙，提高患者的生活質(zhì)量。由于局部結核病灶區(qū)周圍因長期慢性炎癥刺激而產(chǎn)生大量纖維結締組織，血液循環(huán)較差，全身用藥的情況下，局部病灶很難達到有效的抗菌濃度[7]。隨著對疾病研究的不斷深入及內(nèi)固定材料的迅速發(fā)展，對局部病灶已有大量壞死組織及死骨形成的較嚴重患者，普遍認可應盡早行病灶清除+植骨重建內(nèi)固定術[8-9]。即使進行較為徹底的病灶清除術，結核分枝桿菌也難以完全去除，故術后仍要聯(lián)合、長程、大劑量的口服抗癆藥，容易出現(xiàn)各種不良反應，因需堅持每天服藥，病人依從性差。

近十年來，許多研究人員和臨床醫(yī)師嘗試局部用藥，以減輕全身用藥的不良發(fā)應、提高骨關節(jié)結核的治愈率。但是目前臨床上局部用藥的方式較為簡單，即病灶清除術后將抗結核藥物直接噴灑于殘腔中或噴灑于植骨表面再植入殘腔。因病灶清除術后，局部組織有大量的滲液，噴灑在病灶的抗?jié)乘幬锖芸毂粷B液和積血所稀釋，并隨滲液引流出體外，藥物在局部病灶維持時間短，治療效果有限。為了提高局部抗?jié)朝熜В芯咳藛T們開始關注結核藥物緩釋制劑的研究。馬學銘等[10]將利福平載藥微球與硫酸鈣/β-磷酸三鈣復合骨水泥結合制備成一種新型的復合抗結核支架材料，植入SD大鼠的肌袋模型中觀察不同時間點的局部藥物濃度以及血藥濃度，緩釋效果令人滿意，在術后第28天局部藥物濃度仍可達到殺菌濃度。Li等[11]采用3D打印技術制作圓柱型載藥(異煙肼+利福平)復合支架，將其植入新西蘭兔股骨缺損模型，觀察其體內(nèi)釋藥性能和成骨能力，異煙肼和利福平在體內(nèi)局部釋放可持續(xù)12周。骨愈合的關鍵在于成骨細胞連續(xù)不斷的增殖、分化和破骨細胞的骨吸收及胞外基質(zhì)的合成、鈣化。維持較高濃度的局部用藥可以提高抗?jié)朝熜В蔷植扛邼舛鹊乃幬锸欠駮绊懝怯希侵档醚芯亢吞接懙摹NH和RFP作為一線抗結核藥物，抗菌作用強，0.025～0.05 μg/mL的INH即可抑菌，10 μg/mL有殺菌作用，而RFP對結核桿菌的最低抑菌濃度為0.005～0.5 μg/mL，最低殺菌濃度為5 μg/mL。劉江濤等[12]用異煙肼對體外大鼠成骨細胞的毒性作用進行研究，發(fā)現(xiàn)異煙肼濃度在60 μg/mL即可抑制大鼠OB增殖，40 μg/mL時ALP活性明顯下降，20 μg/mL時I型膠原合成明顯減小。Isefuku等[13]用利福平對體外培養(yǎng)的人成骨細胞的毒性作用進行了研究，發(fā)現(xiàn)利福平濃度在10 ug/mL以上時顯著抑制了OB的生長增殖。

本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，INH聯(lián)合RFP在(20+6)μg/mL時抑制大鼠OB增殖及I型膠原合成，使 ALP活性及礦化能力顯著下降。因此，骨關節(jié)結核病灶清除術后，局部應用INH+RFP緩釋制劑的釋放濃度應該控制在(10+3)～(20+6)μg/mL。當INH濃度達到10～20 μg/mL，RFP濃度達到3～6 μg/mL，兩藥聯(lián)合應用即可協(xié)同殺滅結核菌而不影響成骨細胞活性，對細胞無毒性作用，不影響骨愈合。當INH+RFP濃度達到(20+6) μg/mL及以上時，雖然也可以殺滅結核菌，但是對成骨細胞具有抑制作用，影響骨愈合。本研究應用的藥物濃度與體內(nèi)持續(xù)局部抗結核治療有一定的可比性，因為病灶清除術后局部持續(xù)灌洗、注射和緩釋制劑的應用，可以維持局部藥物濃度在一個相對穩(wěn)定的范圍內(nèi)。局部藥物濃度過高，不利于病灶清除術后骨的愈合。體外實驗為進一步體內(nèi)實驗提供理論基礎，應進一步研究異煙肼聯(lián)合利福平局部用藥是否對體內(nèi)的骨修復過程有害。