補腎壯骨方對去卵巢大鼠骨結構和骨代謝作用的研究

陳貝貝 郭魚波 劉海霞 朱如愿 柳辰玥 賈強強 高思華 張東偉

北京中醫藥大學中醫學院糖尿病研究中心，北京 100029

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種以骨量降低，骨微結構破壞，導致骨脆性增加，骨折風險增高為特征的骨代謝性疾病[1]。隨著人口老齡化的加速，骨質疏松癥發病率逐年增高，已成為人類第三大常發慢性病。最新研究顯示，我國骨質疏松癥患病率為13%。估計到2050年，我國骨質疏松癥的患者將達到2.12億[2]。目前，市場上治療骨質疏松的西藥雖能在一定程度上抑制骨量的丟失，緩解腰痛等臨床癥狀，但是大多數藥物存在不同程度的不良反應[3]。中藥以其多靶點、安全性高、不良反應少的特點逐漸成為國內外研究的熱點[4]。

中醫認為，骨質疏松癥屬于“骨痹、骨痿、骨枯”的范疇，其病因病機主要在于腎虛與血瘀，臨床治則多以補肝腎和活血化瘀為主[5]。補腎壯骨方是臨床上常用的經驗方，由丹參、淫羊藿等組成，初步臨床觀察發現，該方能明顯提高骨質疏松患者的骨密度(bone mineral density，BMD)、降低骨折發生率，但是其詳細的作用機理尚未清楚。因此，本研究擬以去卵巢大鼠為研究對象，觀察補腎壯骨方對血清學指標、骨密度、骨微結構和病理結構的影響，探討補腎壯骨方對去卵巢大鼠骨結構和骨代謝的作用和可能的作用機制。

輸水建筑物震損檢查信息包括進口段、啟閉設備、閘門、管道、出口段、電器以及啟閉機房等。壩體內穿壩輸水建筑物與壩體接觸安全性是震后檢查的重要內容，檢查其斷裂、滲漏、接觸沖刷及滲水渾濁程度等情況。安全泄洪洞震損檢查包括進口段、閘門、洞室以及出口段等部位。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1藥物和試劑。補腎壯骨方由丹參、淫羊藿等藥物組成，所有飲片均購自北京同仁堂，經北京中醫藥大學中醫藥博物館馬澤新教授鑒定為正品。按臨床常用方法，制成水提液，濃縮成終濃度為1.4 g(含藥量)/mL， 4 ℃儲存備用，使用前蒸餾水稀釋灌胃。

鈣(Ca)測定試劑盒、磷(P)測定試劑盒、肌酐(Cr)測定試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein，HDL)測定試劑盒、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)測定試劑盒、總膽固醇(total cholesterol，TC)測定試劑盒、甘油三酯(triglyceride，TG)測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，Elisa試劑盒包括檢測I 型膠原氨基端前肽(procollagen I N-terminal propeptide，PINP)、I 型膠原羧基端肽(collagen I carboxyl terminal peptide，CTX-I)、尿脫氧吡啶啉(deoxypyridine，DPD)和骨鈣素(osteocalcin，OCN)均購自Cusabio BIO-Technology Co., Ltd.)，Cathepsin K 抗體(H-130，sc-28867，Santa Cruz，美國)。

模型組(OVX)大鼠骨組織微結構破壞嚴重，與假手術組(SHAM)大鼠相比，其BV/TV、BS/BV、Tb.N、Conn.D顯著降低(P<0.05或0.01)，Tb.Sp、SMI顯著增加(P<0.05或0.01)。與模型組(OVX)大鼠相比，去卵巢大鼠經過阿侖膦酸鈉治療12周后，其BS/BV、Conn.D顯著增加(P<0.05或0.01)，Tb.Sp、SMI顯著降低(P<0.05或0.01)。補腎壯骨方水提液高劑量(SG)和低劑量(SD)治療的去卵巢大鼠，其BS/BV、Conn.D顯著增加(P<0.05或0.01)。同時，補腎健骨方低劑量(SD)能顯著增加BV/TV和Tb.N，降低SMI、Tb.Sp(P<0.05或0.01)。這說明補腎壯骨方對于去卵巢大鼠股骨的骨密度和骨微結構具有一定程度的保護作用，同時其低劑量治療效果相對較好。

“十二五”期末，全國原煤入選能力超過26億t，原煤入選量25.4億t，入洗比例達到65%以上；新建選煤廠180處，能力約8.5億t。

1.2 方法

1.2.1去卵巢大鼠模型的建立。雌性大鼠適應性飼養一周后，參照郭魚波等[6]提供的方法進行。簡述如下：大鼠用1%戊巴比妥鈉(4 mL/kg)腹腔麻醉，摘除兩側子宮角末端粉紅色菜花樣卵巢。假手術組大鼠僅切除兩側卵巢附近等體積的脂肪組織，然后所有大鼠適應性飼養一周。

1.3 檢測指標

大鼠股骨生物力學實驗結果見表4。由表4可知，與假手術組(SHAM)相比，模型組(OVX)大鼠股骨最大載荷、彈性模量、最大應力明顯降低(P<0.05或0.01)。與模型組(OVX)大鼠相比，阿倫膦酸鈉組大鼠股骨的最大載荷、彈性模量、最大應力明顯增加(P<0.05)。去卵巢大鼠給予補腎壯骨方治療12周后，與模型組(OVX)大鼠相比，補腎壯骨方水煎液低劑量組(SD)、高劑量組(SG)大鼠股骨的最大載荷、彎曲強度顯著增加(P<0.05)，但對彈性模量影響不明顯。這說明補腎壯骨方能夠增強去卵巢大鼠的骨強度。

體驗式教學法，是指在教學過程中為了達到既定的教學目的，從教學需要出發，引入、創造或創設與教學內容相適應的具體情境或氛圍，以引起學生的情感體驗，幫助學生迅速而正確地理解教學內容，促進他們心理機能全面和諧發展的一種教學方法。體驗式教學法使學生身臨其境或如臨其境，一則帶給學生從形象的感知到抽象的理性的頓悟，二則激發學生的學習興趣和學習情緒，使學習活動成為自主自發的活動。同時，在教學實踐中，體驗式教學法在英語閱讀課、寫作課研究相對較多，而將其運用到語法課研究的則比較少。[1]

鉑族金屬是一類具有戰略地位的工業金屬，由于其特殊的物理化學性質，鉑族金屬在現代工業、國防 和科技發展中具有關鍵的作用，被譽為現代工業維他命［1］。自然界中鉑和鈀含量極其微小，常以有色金屬的硫化物、砷化物或硫砷化物作為其載體礦物方式存在。在銅、鎳等大宗產品電解精煉冶煉過程中，鉑鈀與金、銀、釕等稀貴金屬均富集于對應的陽極泥中，作為副產物進行回收［2］。

1.3.2骨密度的測定。采用雙能X線(DEXA)小動物成像儀對大鼠股骨進行掃描，選定股骨遠端為興趣區域進行圖像分析，得到股骨的BMD。

1.3.3骨微結構的測定。采用VivaCT40(Scanco medical，瑞士)掃描大鼠股骨，選定股骨頭下0.5 cm為興趣區域進行圖像分析，得到骨表面積與體積分數比(BS/BV)、骨小梁體積分數比(BV/TV)、骨小梁分離度(Tb.Sp)、骨小梁數量(Tb.N)、結構模型指數(structure model index，SMI)和連接密度(Conn.D)參數值，并進行分析比較。

1.3.4骨生物力學測定。采用微機控制電子萬能試驗機(WF-4005，深圳市瑞格爾儀器有限公司)進行三點彎曲實驗。將股骨生理彎曲面向上放置，并使股骨中心、兩支點中心及加載點重合，然后按1 mm/min下降速度加載負荷，根據載荷-位移曲線計算最大載荷、最大應力和彈性模量。

血清中的ALP、PINP和OCN反映骨形成，血清CTX-I和尿液DPD是反映骨吸收的生化指標。各組大鼠血清指標結果見圖1。由圖1可知，與假手術組(Sham)大鼠相比，模型組(OVX)大鼠血清中ALP、CTX-I、OCN、尿液中DPD含量明顯升高(P<0.05或0.01)，血清中PINP含量明顯下降(P<0.05)。與模型組(OVX)大鼠相比，去卵巢大鼠經阿侖膦酸鈉、補腎壯骨方水提液低劑量和高劑量治療后，其血清中ALP、CTX-I、OCN和尿液中的DPD含量降低(P<0.05或0.01)，PINP含量顯著升高(P<0.05或0.01)。

1.3.6Western blot測定Cathepsin K的表達。參照Ma等[8]描述的實驗方法進行，并簡述如下：提取脛骨蛋白，將80μg蛋白溶液加到12%的SDS-PAGE電泳膠電泳，分離后轉印至PVDF膜，然后將膜與Cathepsin K(1∶500)和β-actin(1∶1000)4 ℃共孵育過夜。然后將膜與相應的二抗室溫共孵育1 h，用ECL超敏發光液顯色，Azure c300化學發光成像系統拍照，并用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件進行半定量灰度值分析。

大鼠股骨HE染色結果(物鏡×10)如圖2所示。由圖2可知，假手術組(SHAM)大鼠股骨骨小梁排列緊密，結構完整。模型組(OVX)大鼠股骨骨小梁結構松散不規則，細長疏稀，出現斷裂，脂滴增多。阿侖膦酸鈉組、補腎壯骨方水提液高劑量(SG)和低劑量組(SD) 大鼠股骨骨小梁增多，排列緊密，脂滴數量減少，骨微結構形態得到改善。

1.4 統計學方法

1.2.2動物的分組及給藥。造模一周后，進行陰道涂片實驗，連續5 d無動情周期即為去卵巢實驗成功。取造模成功的大鼠36只，按照體重隨機等分為模型組(OVX)、阿侖膦酸鈉組(ALN)、補腎壯骨方水提液低劑量組(SD)和補腎壯骨方水提液高劑量組(SG)。假手術組大鼠(SHAM)9只。其中，補腎壯骨方水提液低劑量組(SD)、高劑量組(SG)大鼠分別灌服0.7 g/kg和1.4 g/kg的補腎壯骨方水提液，阿侖膦酸鈉組(ALN)灌服阿侖膦酸鈉0.12 g/kg。假手術組和模型組大鼠給予等體積的蒸餾水。各組大鼠連續灌胃12周后，分別取血液、尿液、股骨、脛骨等進行相應的檢測。

2 結果

2.1 補腎壯骨方對去卵巢大鼠血液及尿液中鈣和磷含量的影響

鈣磷等礦鹽是骨組織鈣化的重要成分，其血清和尿液的含量變化可以間接反映出骨礦物質的代謝情況。補腎壯骨方對大鼠血清和尿液鈣磷檢測結果見表1。從表1可知，與假手術組(SHAM)大鼠相比，模型組(OVX)大鼠血清中鈣(S-Ca)和磷(S-P)水平均顯著降低，尿液中的鈣(U-Ca/Cr)、磷(U-P/Cr)水平均顯著增高，差異有統計學意義(P<0.05或0.01)。與模型組(OVX)大鼠相比，阿倫膦酸鈉組、補腎壯骨方水提液低劑量組(SD)血清中鈣(S-Ca)和磷(S-P)水平均顯著升高，尿液中的鈣(U-Ca/Cr)和磷(U-P/Cr)水平均顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05或0.01)； 補腎壯骨方水提液高劑量組(SG)血清中鈣(S-Ca)、磷(S-P)水平均顯著升高，尿液中(U-P/Cr)磷水平顯著降低(P<0.05或0.01)，尿液中鈣(U-Ca/Cr)含量雖有一定程度降低，但差異不具有統計學意義。這說明補腎壯骨方可以改善去卵巢大鼠的鈣磷代謝，從而增加骨組織礦物質含量。

表1 補腎壯骨方對去卵巢大鼠血清和尿液中鈣和磷含量的影響

注：與模型組大鼠相比較，*P<0.05，**P<0.01；與假手術組大鼠相比較，#P<0.05，##P<0.01。

2.2 補腎壯骨方對去卵巢大鼠血清中TC、TG、HDL、LDL含量的影響

脂代謝與骨代謝具有密切相關性[9]。各組大鼠血脂代謝中相關指標檢測結果見表2。由表2可知，與假手術(SHAM)相比，模型組(OVX)大鼠血清中TC、TG、LDL含量明顯升高， HDL含量明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05或0.01)。給予阿侖膦酸鈉、補腎壯骨方水提液低劑量治療12周后，與去卵巢組大鼠相比，大鼠血清中的TC、TG、LDL含量明顯降低，HDL含量明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)；高劑量組大鼠血清中的TC、TG、LDL含量明顯降低(P<0.05或0.01)，HDL含量升高。

2.3 補腎壯骨方對去卵巢大鼠血清ALP、PINP、CTX-I、OCN和尿液DPD的含量的影響

1.3.5骨組織HE染色。取左側股骨組織做成石蠟切片，按照王麗麗等[7]提供方法進行HE染色，封片后置于Olympus BX53倒置顯微鏡拍照觀察骨組織的病理變化。

表2 補腎壯骨方對去卵巢大鼠血清中TC、TG、HDL、LDL含量的影響 Table 2 Effect of Bushen Zhuanggu Compound on the levels of TC, HDL, TG, LDL in the serum of ovariectomized rats s)

注：與模型組大鼠相比較，*P<0.05，**P<0.01；與假手術組大鼠相比較，#P<0.05，##P<0.01。

圖1 補腎壯骨方對去卵巢大鼠血清和尿液骨轉換標志物含量的影響Fig.1 Effect of Bushen Zhuanggu Compound on the levels of serum and urine turnover markers in ovariectomized rats注：與模型組大鼠相比較，*P<0.05，**P<0.01；與假手術組大鼠相比較，#P<0.05，##P<0.01。

2.4 補腎壯骨方對去卵巢大鼠股骨密度和骨組織微結構的影響

骨質疏松不僅導致骨量的降低，同時也會誘發骨組織微結構的破壞。各組大鼠的骨CT實驗結果見表3。與假手術組(SHAM)大鼠相比，模型組(OVX)大鼠的股骨骨密度顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01)。與模型組(OVX)大鼠相比，阿侖膦酸鈉組、補腎壯骨方水提液低劑量組(SD)和高劑量組(SG)大鼠的股骨骨密度顯著升高。

表3 補腎壯骨方對去卵巢大鼠骨密度和骨微結構改變的影響 Table 3 Effect of Bushen Zhuanggu Compound on the changes of micro-structures in ovariectomized rats s)

注：與模型組大鼠相比較，*P<0.05，**P<0.01；與假手術組大鼠相比較，#P<0.05，##P<0.01。

1.1.2動物。3月齡雌性SD大鼠，平均體重220～240 g，購自斯貝福(北京)實驗中心，飼養于北京中醫藥大學科研實驗中心屏障級動物實驗室(合格證號 SCXK(京)2016-0038)，室溫 20 ℃，相對濕度(55±5)%，光暗周期12 h/12 h，普通飼料喂養，實驗期間大鼠自由進食和進水。

2.5 補腎壯骨方對去卵巢大鼠股骨的生物力學的影響

1.3.1血清和尿液生化指標的測定。取血液和尿液，按照試劑盒說明書測定血清中的Ca、P、HDL、LDL、TC、TG、PINP、CTX-I、OCN、DPD的含量；血清堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)用放免法測定。

組別劑量/(g/kg)彈性模量/GPa最大應力/MPa最大載荷/NSHAM-8.51±0.25?255.90±5.74??140.30±4.13?OVX-6.90±0.52#219.00±7.97##124.50±3.59#ALN0.128.55±0.38?236.40±4.36#138.40±2.20?SG1.307.80±0.16256.80±9.08?138.70±4.44?SD0.707.92±0.37242.50±2.52?147.50±7.29?

注：與模型組大鼠相比較，*P<0.05，**P<0.01；與假手術組大鼠相比較，#P<0.05，##P<0.01。

2.6 補腎壯骨方對去卵巢大鼠股骨病理形態的影響

《青苗法》每年獲利息300萬貫。單以熙寧六年為例，青苗利息就達 292萬貫；《免役法》每年獲利1872萬9千3百，而支出只用所入的三分之一；《市易法》每年息錢和市利錢多達達133萬2千緡之多。不僅如此，各州縣歲收也大大增加。據統計，“諸路常平、免役、坊場、河渡、戶絕莊鄉之錢粟積于州縣者無慮數十百巨萬”，如作為地方政府經費，“可以支24年用”。 以上四組材料，充分說明王安石變法確實達到了“富國”的目的。

對于我國的智能電網，從當前的使用來看，遺傳算法和神經網絡這兩種算法得到了廣泛的應用，這也讓電力系統智能化能夠有一個非常堅實的基礎。神經網絡能夠對電力系統中一些復雜的非線性問題進行計算，從而解決問題，而基礎為生物神經系統的人工神經網絡，由于其科學化、高效化以及智能化的特點，在智能電網的應用非常的普及。同時也隨著現代科學技術的飛速發展，我國對于智能電網的建設腳步也不斷的加快，繼電保護技術智能化的發展也越來越迅速。同時，對神經網絡方法進行運用，分析系統故障的樣本信息，能夠在最快的之間只能發現發生故障的部位，從而對故障能夠及時的進行排除，讓系統的工作效率有效提升。

圖2 大鼠股骨HE染色(物鏡×10)Fig.2 HE staining of femur in rat (objective len×10)

2.7 補腎壯骨方對去卵巢大鼠骨組織Cathepsin K表達的影響

各組大鼠骨組織中Cathepsin K的表達結果見圖3。由圖3可知，與假手術組(SHAM)大鼠相比，模型組(OVX)大鼠股骨組織中的Cathepsin K的表達明顯升高(P<0.05)；與模型組(OVX)大鼠相比，阿侖膦酸鈉和補腎壯骨方(低劑量和高劑量)能顯著降低去卵巢大鼠Cathepsin K的表達水平(P<0.05)，其中低劑量效果在降低Cathepsin K表達水平方面效果更明顯(P<0.01)。這說明補腎壯骨方可能通過抑制Cathepsin K 表達進而改善骨質量。

圖3 大鼠骨組織Cathepsin K的表達結果Fig.3 Cathepsin K expression in bone tissue注：與模型組大鼠相比較，*P<0.05，**P<0.01；與假手術組大鼠相比較，#P<0.05，##P<0.01。

3 討論

中醫認為，腎藏精主骨、肝藏血主筋、肝腎同源而精血互生。腎功能失常如腎精虛或腎氣虛，則會導致骨骼失養，痿軟無力。肝腎生理功能異常，則可能導致骨質疏松。肝血不足可導致腎精虧損。肝血虛則筋脈失養，肢體屈伸不利，筋骨運動失常，從而誘發骨痿[10]。補腎活血方由丹參、淫羊藿、熟地等組成。其中，丹參能活血化瘀，熟地黃具有補肝腎強筋骨的功效，淫羊藿具有溫腎精、強筋骨的功效。基礎研究也表明，丹參[11]、地黃[12]、淫羊藿[13]單獨應用能明顯改善骨質疏松動物的骨微結構和骨質量。臨床觀察也表明，該方能顯著改善骨質疏松患者的臨床癥狀，減輕患者骨量的丟失。

骨代謝的異常是誘發骨結構破壞和骨質疏松的主要原因。鈣和磷是骨組織的主要成分，研究發現骨質疏松患者的鈣和磷的排泄量明顯增加。本實驗研究也發現，補腎壯骨方能顯著抑制去卵巢大鼠尿鈣和磷的排泄，提高血清中鈣和磷的含量。同時也發現，去卵巢大鼠骨膠原降解加速，表現為血清中PINP的含量明顯降低，血液中的CTX-I和尿液中DPD的含量明顯升高。給予去卵巢大鼠補腎壯骨方治療12周，能明顯逆轉骨膠原血清學指標，抑制去卵巢誘發的骨吸收。同時，本研究用骨生物力學、骨密度和骨微結構評價補腎壯骨方對骨物理性質的影響。實驗結果表明，該方能明顯提高去卵巢大鼠股骨的最大載荷和彎曲強度，抑制骨量的丟失以及骨微結構的破壞。

去卵巢誘發的骨質疏松是一種高轉換狀態的骨代謝過程，表現為血清中ALP活性明顯增高[14]。補腎壯骨方能明顯降低血清中ALP的活性，抑制骨代謝的高轉換率。OCN是由成骨細胞生成并特異性分泌的非膠原蛋白。研究發現，去卵巢大鼠的OCN含量明顯降低[15]，這提示成骨細胞的骨形成能力明顯降低。本實驗研究發現，該方能提高去卵巢大鼠血清OCN的含量，從而促進骨形成。

（三）僅注重軟件的操作和結果的分析，卻忽視了對統計原理的深度分析和統計思想的逐步滲透，理論講授不夠立系統、深入和立體。

Cathepsin K活性的增高誘發破骨細胞骨吸收增強，是去卵巢誘發骨質疏松的主要原因之一[16]。研究發現，淫羊藿的主要成分淫羊藿苷(icariin)能通過抑制Cathepsin K的活性而抑制膠原誘發的骨關節炎[17]。筆者前期研究也發現丹參的主要水溶性成分丹酚酸B能降低高脂飲食小鼠牙槽骨組織Cathepsin K的表達水平改善骨代謝[7]。丹參脂溶性成分丹參酮也能抑制Cathepsin K的活性[18]。本實驗研究也證明，以丹參和淫羊藿為主要成分的補腎壯骨方能降低骨組織Cathepsin K的表達。這說明該方抗去卵巢誘發的大鼠骨量降低的機理之一可能在于抑制Cathepsin K的活性。

4 結論

本實驗通過觀察補腎壯骨方對去卵巢大鼠血清和尿液的骨代謝指標、骨微結構和骨生物力學的影響，證明補腎壯骨方能夠增強去卵巢大鼠的骨生物力學和改善骨微結構可能與改善骨代謝、抑制骨吸收和促進骨形成有關。這為其臨床應用預防和治療骨質疏松癥提供了實驗依據。這種骨組織的保護作用可能與抑制Cathepsin K的活性有關，但該方抗骨質疏松的深層次分子機制有待于進一步探討。