乙醛脫氫酶2基因G487A位點多態性與老年2型糖尿病患者冠狀動脈狹窄及其嚴重程度的關系研究

吳和弟，許麗娃，吉家釵，陳訓春，王少津

乙 醛 脫 氫 酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）是乙醇代謝過程中的關鍵酶，由多個分子組成，其中ALDH2是肝臟中與乙醛有最低km值（3 μmol/L）的活性最強的同工酶［1］。飲酒后乙醇主要在肝臟進行代謝，其代謝途徑為乙醇-乙醛-乙酸-乙酰輔酶A-三羧酸循環［2］，代謝過程中乙醇脫氫酶（ADH）催化乙醇氧化為乙醛，ALDH催化乙醛氧化為乙酸。既往研究表明，ALDH2基因多態性與蒙古人酒精耐受性有關［3］。CARLSSON等［4］研究表明，ALDH2基因多態性與2型糖尿病（T2DM）有關。MURATA等［5］研究表明，ALDH2基因多態性影響T2DM患者血糖。目前，有關ALDH2基因多態性與T2DM患者冠狀動脈狹窄關系的研究報道較少。本研究旨在探討ALDH2基因G487A位點多態性與老年T2DM患者冠狀動脈狹窄及其嚴重程度的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年10月—2016年10月?？谑腥嗣襻t院收治的老年T2DM并冠狀動脈狹窄患者60例作為研究組，另選取同期老年T2DM患者54例作為對照組，參照《2011年美國糖尿病學會糖尿病醫學診治標準》中的T2DM診斷標準［6］，以冠狀動脈造影顯示冠狀動脈狹窄率≥50%定義為冠狀動脈狹窄。納入標準：（1）年齡≥60歲；（2）無嗜酒史。排除標準：（1）近半年內發生急性腦血管疾病、嚴重創傷者；（2）有冠狀動脈介入治療史者；（3）合并嚴重肝、腎功能不全者；（4）合并血液系統疾病者。本研究經海口市人民醫院醫學倫理委員會審核批準，所有患者知情并簽署知情同意書。

1.2 觀察指標

1.2.1 一般資料 收集兩組患者一般資料，主要內容包括性別、年齡、體質指數（BMI）、吸煙情況、飲酒量及飲酒面紅反應發生情況。以連續或累積吸煙≥6個月定義為吸煙；飲酒量以drink為單位，白酒44 ml、紅酒118 ml、啤酒355 ml為1 drink［7］；飲酒面紅反應：飲酒或引用含乙醇飲料后面部迅速變紅。

1.2.2 實驗室檢查指標 采集兩組患者肘靜脈血3 ml，室溫靜置20 min，2 500 r/min離心15 min（離心半徑10 cm），收集上層血清并置于-80 ℃冰箱中保存待測。采用美國雅培C16000全自動生化分析儀檢測血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）及纖維蛋白原（FIB）。

1.2.3 基因多態性 采集兩組患者肘靜脈血3 ml，置于含乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中搖勻，2 500 r/min離心5 min（離心半徑10 cm），分離上層血漿并置于-80 ℃冰箱中密封保存。采用吸附柱法提取基因組DNA并進行聚合酶鏈式反應（PCR）擴增反應，ALDH2基因G487A位點引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成：上游引物：5'-GTCAACTGCTATGATGTGTTTGG-3'，下游引物：5'-CCACCAGCAGACCCTCAA-3'。PCR 反應體系 50 μl：2 μl樣本DNA溶液，25 μl ALDH2擴增液，引物各2 μl，雙蒸水補充至50 μl。PCR反應條件：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性45 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共進行35個循環；72 ℃延伸5 min。取擴增產物200 bp，采用2%瓊脂糖凝膠電泳分離擴增產物，溴化乙錠染色，紫外線分析凝膠成像系統下觀察電泳結果，將出現清晰單一目標條帶的PCR擴增產物送至海南華大基因生物科技有限公司進行基因片段測序。

1.2.4 冠狀動脈造影 采用Judkins法行冠狀動脈造影，右冠狀動脈造影投照左前斜、正位+頭部2個體位，左冠狀動脈造影投照左前斜+頭位、左前斜+足位、右前斜+頭位、右前斜+足位、正位+頭位5個體位。由兩位有經驗的醫師分析冠狀動脈造影光盤，根據冠狀動脈病變支數分為單支病變、雙支病變及三支病變；采用Gensini積分評估冠狀動脈狹窄程度，Gensini積分標準：冠狀動脈狹窄率≤25%記1分，26%～50%記2分，51%～75%記4分，76%～90%記8分，91%～99%記16分，100%記32分；冠狀動脈分支評分為狹窄率評分乘以各節段系數：左主干×5，左前降支近段×2.5、中段×1.5、遠段×1，第一對角支×1，第二對角支×0.5，左回旋支近段×2.5、鈍緣支×1、遠段×1.5、后降支×1、后側支×0.5，右冠狀動脈近段×1、中段×1、遠段×1、后降支×1。各節段評分之和為Gensini積分。

1.3 統計學方法 應用SPSS 23.0統計學軟件進行數據處理，計量資料以（x± s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數資料分析采用χ2檢驗；老年T2DM患者冠狀動脈狹窄的影響因素分析采用多因素Logistic回歸分析，基因型與老年T2DM并冠狀動脈狹窄患者Gensini積分、冠狀動脈病變支數的相關性分析采用Spearman秩相關分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者一般資料和實驗室檢查指標比較 兩組患者性別、年齡、BMI、吸煙率及血清TC、TG、LDL-C、HDL-C、FIB水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；研究組患者飲酒量大于對照組，飲酒面紅反應發生率高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表1）。

2.2 兩組患者基因型及等位基因分布頻率比較 兩組患者基因型及等位基因分布頻率比較，差異有統計學意義（P＜0.05，見表2）。

2.3 多因素Logistic回歸分析 將冠狀動脈狹窄作為因變量，將飲酒量、飲酒面紅反應及基因型作為自變量（變量賦值見表3）進行多因素Logistic回歸分析，結果顯示，飲酒量、飲酒面紅反應及基因型是老年T2DM患者冠狀動脈狹窄的獨立影響因素（P＜0.05，見表4）。

表2 兩組患者基因型及等位基因分布頻率比較〔n（%）〕Table 2 Comparison of genotypes and allele distribution frequencies between the two groups

表3 變量賦值Table 3 Variable assignment

2.4 不同基因型老年T2DM并冠狀動脈狹窄患者Gensini積分和冠狀動脈病變支數比較 不同基因型老年T2DM并冠狀動脈狹窄患者Gensini積分和冠狀動脈病變支數比較，差異有統計學意義（P＜0.05，見表5）。2.5 相關性分析 Spearman秩相關分析結果顯示，基因型與老年T2DM并冠狀動脈狹窄患者Gensini積分（rs=0.451，P=0.042）、冠狀動脈病變支數（rs=0.412，P=0.044）呈正相關。

表1 兩組患者一般資料和實驗室檢查指標比較Table 1 Comparison of general information and laboratory examination results between the two groups

表4 老年T2DM患者冠狀動脈狹窄影響因素的多因素Logistic回歸分析Table 4 Multivariate Logistic regression analysis on influencing factors of coronary artery stenosis in elderly patients with T2DM

表5 不同基因型老年T2DM并冠狀動脈狹窄患者Gensini積分和冠狀動脈病變支數比較Table 5 Comparison of Gensini score and number of coronary artery lesions in elderly T2DM patients complicated with coronary artery stenosis with different genotypes

3 討論

ALDH是一種四聯體蛋白，目前已發現其共有19種同工酶，是多種醛類代謝的關鍵酶。突變型ALDH2基因第12外顯子發生G-A突變，導致487位氨基酸發生谷氨酸-賴氨酸的替換，使整個分子空間結構發生改變，進而導致ALDH2酶活性喪失，乙醛代謝受抑制而使乙醛堆積［8-9］。研究表明，編碼ALDH2的基因具有多態性，野生型G487A具有催化活性，突變型G487A失去催化活性［10］。近年來研究發現，ALDH2基因多態性與心血管疾病有關，G487A等位基因突變可能與中國、韓國、日本人冠心病發病機制有關［11-12］；ALDH2對心肌缺血具有保護作用［13］；而攜帶ALDH2突變基因的T2DM患者血糖控制效果較差［5］，提示ALDH2基因在冠心病和T2DM發病中具有重要作用。但ALDH2基因多態性與老年T2DM患者冠狀動脈狹窄的關系尚未完全明確。

本研究選取無嗜酒史患者，可排除短期內飲酒導致乙醛堆積現象。本研究結果顯示，研究組患者飲酒量大于對照組，飲酒面紅反應發生率高于對照組，且兩組患者基因型及等位基因分布頻率間有統計學差異，提示飲酒量、飲酒面紅反應及ALDH2基因G487A位點多態性可能與老年T2DM患者冠狀動脈狹窄的發生有關；進一步行多因素Logistic回歸分析結果顯示，校正飲酒量、飲酒面紅反應后，ALDH2基因G487A位點多態性是老年T2DM患者冠狀動脈狹窄的獨立影響因素，分析原因可能如下：（1）突變型ALDH2基因活性降低，導致醛類堆積，炎性因子增加，促進斑塊形成，進而導致冠狀動脈狹窄發生［14］；（2）ALDH2是硝酸甘油代謝的關鍵限速酶，ALDH2基因突變使硝酸甘油轉化為一氧化氮（NO）的過程受阻，導致血管擴張作用減弱、血管內皮功能紊亂，進而促進冠狀動脈狹窄發生。本研究結果還顯示，基因型與老年T2DM并冠狀動脈狹窄患者Gensini積分、冠狀動脈病變支數呈正相關，提示ALDH2基因G487A位點多態性與老年T2DM患者冠狀動脈狹窄嚴重程度有關。

綜上所述，ALDH2基因G487A位點多態性與老年T2DM患者冠狀動脈狹窄及其嚴重程度有關。但本研究為單中心研究，且樣本量較小，所得結論仍有待聯合多中心、擴大樣本量進一步證實。

作者貢獻：吳和弟進行文章的構思與設計，數據收集、整理、分析，負責撰寫論文；吳和弟、許麗娃進行研究的實施與可行性分析；吳和弟、吉家釵、陳訓春進行結果分析與解釋；王少津負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責，監督管理。

本文無利益沖突。