CRISPR/Cas系統在人眼相關疾病中的應用

姜夢圓，劉紅玲

0引言

目前的DNA編輯方法可以根據其靶向機制大致分為兩組：蛋白質定向和核苷酸定向的編輯技術。鋅指核酸酶(zinc finger nuclease，ZFNs)和轉錄激活物樣效應核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALENs)是研究最多的蛋白質定向DNA編輯技術，而CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated gene)技術是一種核苷酸定向的DNA編輯技術。CRISPR/Cas技術在誘導遺傳修飾方面顯示了更高的效率，并且它不涉及靶特異性蛋白質，只需要調整單個sgRNA的短區域便可以實現靶向特異性，故較ZFNs和TALENs表現出明顯的優勢。此外，基于CRISPR的方法可以規避病毒載體能力的局限性，因此CRISPR/Cas系統可以廣泛應用于研究及治療各種疾病[1-2]。研究報道1/4～1/3的人類疾病與遺傳密切相關。現已發現的遺傳性疾病約有4000種，其中遺傳性眼病和有眼部表現的全身遺傳性疾病約有600種[3]。由于這些疾病的病因尚未完全闡明且無有效的治療方法，因此嚴重影響患者的視力和生活質量。近幾年隨著CRISPR/Cas系統的研究和發展，遺傳性眼病的致病機制在基因水平上得到進一步詮釋，從而為今后應用CRISPR/Cas系統治療此類疾病帶來了新的希望。

1 CRISPR/Cas系統概述

成簇的規律間隔的短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR)是由一系列短的高度保守的正向重復序列(repeats)與長度相似的間隔序列(spacers)間隔排列組成。CRISPR位點附近存在著一系列保守的CRISPR相關基因(CRISPR-associated gene，Cas)，Cas基因編碼的蛋白具有核酸相關的功能域。CRISPR位點的第一個重復序列上游有CRISPR前導序列，即啟動子，啟動CRISPR序列的轉錄，轉錄產生的非編碼RNA被命名為CRISPR RNAs(crRNA)。這些crRNA和Cas蛋白共同參與CRISPR免疫防御過程[4]。

1987年，CRISPR序列在大腸桿菌的基因組中被首次發現，隨后，在其他細菌和古菌中也發現了這一特殊序列。2005年，發現這些CRISPR序列和噬菌體的基因序列匹配度很高，說明CRISPR 可能參與了微生物的免疫防御。2011年，CRISPR/Cas系統的分子機制被揭示：當病毒首次入侵時，細菌會將外源基因的一段序列整合到自身的CRISPR的間隔區；病毒二次入侵時，CRISPR 轉錄生成前體crRNA (pre-crRNA)，pre-crRNA 經過加工形成含有與外源基因匹配序列的crRNA，該crRNA與病毒基因組的同源序列識別后，介導 Cas 蛋白結合并切割，保護自身免受入侵。直到2012年，Jinek等[5]發現了鏈霉菌屬中的Type II型CRISPR-Cas系統，至此實現了基因編輯的重大突破。在醫學領域，CRISPR/Cas9基因編輯技術也在構建疾病模型及修復疾病模型方面顯現出獨特的優勢。

II型CRISPR-Cas9系統由Case9核酸酶和單一的向導RNA(single guide RNA)組成。在sgRNA的指引下，Case9核酸酶對靶標DNA的特異性剪切主要通過識別保守的原間隔序列臨近序列(protospacer adjacent motif，PAM)來進行[6]。靶標DNA斷裂后，可以通過兩種機制進行修復。如果沒有同源模板則直接修復，發生非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)。如果存在同源模板，則發生同源性定向修復(homology directed repair，HDR)[2]。

2 CRISPR/Cas系統在眼科學中的應用

2.1CRISPR/Cas系統在遺傳性視網膜疾病中的應用視網膜退行性疾病進展不可逆轉，且視網膜再生潛能小，如何治療視網膜退行性疾病成為了研究者們面臨的重要挑戰。遺傳性視網膜退行性疾病具有不同臨床表現和不同的基因突變形式，晚期由于漸進性光感受器死亡而最終出現不可逆轉的失明。目前患有遺傳性視網膜疾病的患者約有2000萬人，還沒有接受可靠有效的治療。隨著基因編輯技術的發展，基因和細胞治療有望為這類疾病提供新的治療前景[7]。迄今為止，已經發現有250個基因與視網膜退行性疾病的發展相關。利用CRISPR/Cas系統可以對這類疾病的相關基因進行前沿性研究[5]。

2.1.1CRISPR/Cas系統在Leber先天性黑矇的應用Leber先天性黑矇(Leber congenital amaurosis，LCA)是一種遺傳性視網膜營養不良性疾病，于150a前被Theodor Leber首次報道。LCA主要表現為在出生時或出生后不久即出現視力喪失，鐘擺樣的眼球震顫，瞳孔黑矇及色素性視網膜變性[7]，其患病率約為1/3000，約占所有遺傳性視網膜營養不良的5%。

LCA患者最常發生突變的基因是中心體蛋白290 kDa(CEP290)基因，這種突變基因引起的LCA被稱為LCA10[8]。在CEP290突變中，最常見的是內含子26的突變(也稱為IVS26突變)。Ruan 等[8]應用CRISPR/Cas9系統將CEP290剪接突變引入到293FT細胞，構建了模擬LCA10的細胞模型。并且通過特定的sgRNAs和Cas9的組合切除CEP290基因中的IVS26突變，發現可以有效地糾正LCA細胞模型中的IVS26突變。并通過構建動物模型，發現sgRNA和SpCas9的組合可以敲除小鼠中突變的CEP290基因。研究者還開發了限制SpCas9表達的自限性CRISPR/Cas9系統，發現該系統仍能誘導CEP290的靶向缺失，同時降低了脫靶效應并提高了系統的安全性。這些研究結果為今后應用CRISPR/Cas9系統治療此類疾病帶來了新的希望。

誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)具有替代自體細胞的潛能。但是，對于許多遺傳性疾病的治療可能需要移植前的基因修飾。Burnight 等[9]通過CRISPR/Cas9介導的非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)切除了LCA10患者iPSCs中致病基因的IVS26突變，完成了iPSCs中的轉錄物和蛋白質的校正。因此Burnight 等認為CRISPR/Cas9系統可以用來糾正遺傳性視網膜變性的多種遺傳變異。

2.1.2CRISPR/Cas系統在視網膜色素變性中的應用視網膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)是一種視網膜退化性疾病，常伴有夜盲癥、管狀視力、致盲等表現，具有高遺傳性和異質性，發病率約1/4000，并且正在成為世界范圍內不可逆失明的重要原因。目前已明確70余種基因與這種具有不同表型的視網膜退化性疾病相關[7，10]。

前體信使RNA(pre-mRNA)剪接是真核細胞中必不可少的生物學過程。許多剪接體基因中的遺傳突變引起人眼相關疾病。Pre-mRNA剪接因子——RP9的突變易導致常染色體顯性遺傳視網膜色素變性(autosomal dominant retinitis pigmentosa,adRP)。Lv等[10]利用CRISPR/Cas9系統在體外進行Rp9基因敲除(KO)和點突變敲入(KI)，通過MTT方法，發現Rp9-KI和Rp9-KO細胞生長速率降低。通過western blot法發現Rp9-KI和Rp9-KO細胞增殖被抑制。通過體外劃痕實驗發現Rp9-KI和Rp9-KO細胞遷移減少。通過RNA-Seq的基因表達譜分析證明RP相關基因Bbs2和Fscn2在Rp9-KI和Rp9-KO細胞中顯著下調。并通過RT-PCR方法發現，Rp9-KI和Rp9-KO不影響Bbs2剪接，但Fscn2基因的Pre-mRNA剪接明顯受到影響。這表明并非所有的剪接都對Rp9突變同樣敏感。這些研究結果揭示了RP9表達和疾病特異性基因之間的功能關系，并提供了RP9相關性RP疾病機制的新見解。

大多數adRP患者具有視紫紅質RhoS334基因突變[11]。Bakondi等[12]在攜帶RhoS334ter突變的adRP大鼠模型中，通過電轉染在視網膜下注射gRNA/Cas9質粒，進而選擇性地將攜帶RhoS334ter突變的視紫紅質基因刪除。免疫組化顯示表型改變是顯而易見的，表現為感光突觸和視網膜突觸的保存。這表明這一策略可阻止視網膜退化，改善視覺功能。

2.2CRISPR/Cas系統在新生血管性疾病中應用血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在血管生成中起著關鍵作用，與多種人類疾病相關，如增殖性糖尿病視網膜病變(proliferative vitreoretinopathy，PVR)和年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)等。PVR是目前工作年齡人群中獲得性失明發生率最高的疾病，而ARMD是65歲以上人群失明的主要原因[13]。盡管抗VEGF藥物可以減少新生血管的生長并減少血管滲漏，但是由于VEGF會持續從病變的視網膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelium，RPE)分泌，這些抗VEGF藥物必須多次注射[14]。而基因治療因其長效表達會減少或消除對患者重復注射抗-VEGF抑制劑的需要而具有優勢[15]。

2.2.1CRISPR/Cas系統在ARMD中的應用ARMD的發病機制可能與RPE和Bruch膜之間形成的基底膜沉積有關，且涉及補體系統的激活。ARMD與EFEMP1相關性黃斑變性具有相似的臨床特征，如基底膜沉積物和玻璃膜疣，EFEMP1相關性黃斑變性是由人包含EGF腓骨蛋白樣胞外基質蛋白1(EFEMP1)中的顯性p.R345W突變引起的。為了研究在ARMD中Bruch膜，RPE和補體之間的關系，Fernandez-Godino 等[16]應用CRISPR/Cas9系統設計了含有p.R345W突變的ARPE-19細胞,通過免疫染色及transwells方法，發現由p.R345W突變引起的細胞外基質(ECM)結構及組成的變化會導致RPE細胞產生補體激活和形成基底沉積。值得注意的是，當人胎兒RPE細胞在ARMD患者的Bruch膜上培養時，也觀察到類似的反應，這表明通過異常ECM刺激補體激活是遺傳性和年齡相關性黃斑變性的早期發病機制中的共同因素。這些研究使我們部分了解了黃斑變性的早期發病機制。

ARMD與VEGF基因的過度表達有關。其中VEGFA是血管生成中的重要因素，因此它是治療ARMD的主要靶點。Kim 等[14]通過激光誘導產生含有脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)的ARMD小鼠模型，并將預先組裝的VEGFA基因特異性Cas9核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)注射到小鼠視網膜下來研究Cas9 RNP是否可用于在ARMD小鼠模型中治療CNV。他們發現在小鼠模型中，Cas9 RNP可以有效地減少CNV的面積，且通過Digenome-seq進行全基因組分析表明，在基因組中很少誘導脫靶突變。這些研究結果表明,可使用Cas9 RNPs靶向滅活視網膜中的VEGFA，用于ARMD的局部治療。并且他們認為，基因治療不僅是一個設想，在不久的將來醫生可以運用基因治療來治療疾病。

2.2.2CRISPR/Cas系統在PVR中的應用小鼠雙微體2(MDM2)是一種E3泛素蛋白連接酶，研究表明MDM2 SNP309G與PVR相關[17]，但MDM2 SNP309G是否參與PVR的發展尚不清楚。Zhou 等[18]應用CRISPR/Cas9系統及含有MDM2 G309的DNA模板構建表達MDM2T309G或T309T的hRPE細胞模型，并向兔眼玻璃體腔內注射表達MDM2 T309G或T309T的hRPE細胞。Western印跡分析表明表達MDM2T309G的細胞中p53含量較表達MDM2T309T的細胞明顯降低。此外，與兔眼玻璃體腔內表達MDM2T309T的hRPE細胞相比， 表達MDM2T309G的hRPE細胞收縮顯著增強，并且hRPE細胞中的MDM2T309G增強了兔模型中PVR的發展。實驗結果表明RPE細胞中的MDM2 SNP309可能增強PVR發病幾率。

2.3CRISPR/Cas系統在眼科其他人眼相關疾病中的應用

2.3.1CRISPR/Cas系統在眼部發育中的應用Pax6是一種含同源結構域的轉錄因子，對于大多數動物(包括果蠅、小鼠和人供體類)以及胰腺內分泌細胞的神經發育，以及分化中的眼睛及鼻腔發育至關重要。已有研究結果表明，Pax6突變的影響取決于突變的程度和基因劑量。為了證明不同劑量的Pax6基因對眼睛的影響，Yasue 等[19]應用CRISPR/Cas9系統建立了Pax6基因缺陷的小鼠模型。形態學和基因組分析表明，經Pax6-CRISPR編輯的具有不同的Pax6突變劑量的胚胎具有不同的眼睛表型。實驗結果表明Pax6的中度表達可能導致視網膜過度增殖，且來自表面外胚層的晶狀體發育比來自視泡囊的視網膜發育需要更高的Pax6基因劑量。這提示CRISPR/Cas9系統可控制小鼠模型中的基因劑量，為眼睛發育相關研究提供了方向。

2.3.2CRISPR/Cas系統在原發性開角型青光眼中的應用原發性開角型青光眼(primary open-angle glaucoma，POAG)是全球不可逆轉的視力喪失的首要原因，Myocilin(MYOC)突變可見于4%的POAG患者。研究表明MYOC突變導致蛋白質錯誤折疊，使小梁中的內質網應激，從而導致眼壓升高，引起POAG。Jain 等[20]應用CRISPR/Cas9系統編輯小鼠小梁網細胞并構建了小鼠MYOC突變株，進而選擇性地將MYOC突變刪除。實驗結果證明通過這項基因編輯技術可以降低眼壓，證明了這項基因編輯技術在眼科這項重要疾病中的可行性。

2.3.3CRISPR/Cas系統在先天性白內障中的應用先天性白內障會導致新生兒雙眼盲，之前研究表明有近1/3的先天性白內障與晶體基因突變相關，如aA-晶體蛋白基因(CRYAA)。Yuan 等[21]通過向兔受精卵的細胞質中注射Cas9 mRNA和sgRNA，人工構建CRYAA突變的兔模型，表現為先天性白內障、小眼球與早期晶狀體萎縮以及晶狀體纖維分化失敗。因此，利用CRISPR/Cas構建的兔模型為進一步闡明CRYAA基因的致病機制提供了良好工具。

3展望

CRISPR/Cas9系統作為一種快速發展的革命性技術，在基因編輯方面展現出巨大的潛力，已有大量報道表示CRISPR/Cas9系統可以精確敲除、插入或替換細胞水平的目標基因，甚至可以用來構建動物模型。與其他基因組定位編輯技術相比，CRISPR/Cas9系統具有更高效的基因編輯效率，操作更方便，同時安全性高，毒性小，脫靶效應相對較低。

雖然CRISPR/Cas系統具有良好的前景，但如何將該系統的各個組分直接高效地運輸到細胞中仍是一個不小的挑戰。目前，Rubul等[22]通過將金納米顆粒與Cas9蛋白及sgRNA組成復合體，成功實現了CRISPR/Cas系統向細胞質及細胞核的轉運，在細胞中實現了高達90%的運輸效率。

此外，CRISPR的最新研究進展是尋求一種手段來導致單核苷酸的改變[23-24]。這一改變通過將去活化的Cas核酸酶(dead Cas，dCas)與嚙齒動物胞嘧啶脫氨酶融合來實現。dCas /脫氨酶融合蛋白轉染的細胞經歷單個胞嘧啶至尿嘧啶的轉化，隨后通過DNA校正機制或在復制過程中將其修復為胸腺嘧啶。該系統整體效率的提高及插入錯誤的減少代表了CRISPR技術的巨大進步和發展[15]。

CRISPR/Cas9系統目前已被應用于動物遺傳性疾病的治療，同時也正在推進用于臨床上治療人類疾病。盡管與傳統基因編輯技術相比具有明顯優勢，但圍繞CRISPR/Cas系統的技術問題和倫理問題阻礙了其臨床使用[25]。

第一個存在的問題是脫靶效應。與小鼠及斑馬魚相比，人類細胞中脫靶突變存在更常見[25-26]。最近，開發了一種可逆的基于CRISPR的基因編輯策略，稱為CRISPR干擾(CRISPRi)。該技術對sgRNA與靶序列之間的錯配高度敏感，因此與常規使用的RNAi相比減少了靶向脫靶效應[15]。此外，目前也采用了諸如sgRNA設計的優化，成對的nCas9的使用，配對的dCas9-FokI核酸酶和增強的Sp-Cas9的方法來解決脫靶問題[27-28]。然而，仍然存在一個問題：脫靶效應是否能夠針對數十億個DNA序列中涉及大量細胞的單一位點進行治療，并且是針對個體患者進行特異性和不同設計的治療[25]。

此外，使用CRISPR來編輯人類種系已引起科學界的倫理爭論。例如，應用CRISPR技術可使運動表現或智力能力提高，如果只有特定的個人能夠獲得這種提高，就會造成社會問題[21]。

由于許多人眼相關疾病的病因尚未完全闡明且無有效的治療方法，因而嚴重影響患者的生活質量。雖然目前圍繞CRISPR/Cas系統仍存在很多問題，但隨著技術的進一步完善，針對倫理問題等相關政策的進一步建立，CRISPR/Cas系統在人眼相關疾病中的前景十分可期。