蓮藕資源耐鹽性評價

周志疆，張 楨，蔣潤枝，惠林沖，程立寶*

（1.江蘇豐收大地種業發展有限公司，江蘇 鹽城 224000；2.揚州大學，江蘇 揚州 225000）

蓮藕是多年生宿根水生草本植物，因其豐富的營養成分和較高的保健作用，成為深受人們喜愛的水生蔬菜之一[1]。近幾年，由于對蓮藕加工產品的不斷開發利用，蓮藕已成為我國重要的出口創匯蔬菜之一[2]。荷花花色艷麗、香味高雅，是中國園林中重要的水景布置植物材料。蓮因其藥食兼用和觀賞價值，深受廣大人民喜愛[3]。

植物在受鹽脅迫時，通過一系列的細胞滲透壓和離子平衡途經降低或抵消鹽分的傷害，以維持正常生長發育的行為稱作植物的耐鹽性[4]。目前，有關植物耐鹽性鑒定和品種篩選的研究有很多。植物的耐鹽性是植物體內一系列因素綜合作用的結果，鹽脅迫下，植物根系總吸收面積受到抑制，隨著鹽脅迫時間的不斷增加，根系吸收能力持續下降，導致光合速率下降，植物葉綠素含量不斷降低。正常生長狀態下，植物活性氧的形成和消除處于動態平衡，植物遭受鹽脅迫后，導致自由基積累，引起植物氧化損傷，但是超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）等作為植物體內抗氧化酶系統的重要組成部分，能夠有效加強活性氧清除能力，緩解鹽對植物的傷害。根系活力、酶活性、葉綠素含量、質膜相對透性等生理指標均可以衡量植物受到鹽脅迫后的傷害，這些單一生理指標存在差異性；所以，很難用單一的某個生理指標來評價植物的耐鹽性。

近年來，不斷惡化的土壤環境制約著農作物的生長發育，土壤鹽漬化是土壤生產力發生劣變的常見現象，我國土壤鹽漬化已經嚴重制約了農業的可持續發展。調查表明，在鹽漬化較高的地區，通過栽培蓮藕，既能取得一定的經濟效益，又能達到以水洗鹽、以水壓鹽的目的，同時改良土壤環境。到目前為止，國內外關于蓮藕耐鹽性狀的研究較少，本試驗通過綜合評價篩選蓮藕耐鹽資源，以期為設施鹽漬化土壤和沿海灘涂地區選育適合栽培的耐鹽蓮藕新品種提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

以揚州大學園藝與植物保護學院水生蔬菜實驗室保存的E1、E2、E3、E4、H2、H5、H8蓮藕資源為試驗材料。

1.2 方法

1.2.1 試驗方案

2017年5月，于揚州大學水生蔬菜試驗基地防雨棚內準備長×寬×高分別為60 cm×40 cm×30 cm且鋪2層0.08 mm厚的塑料薄膜的泡沫箱，每個泡沫箱中裝土0.048 m3，種植4株種藕后裝滿水，每個蓮藕資源種植9箱。種藕大小基本一致，且帶頂芽。待蓮藕匍匐莖長出7、8條時，倒出泡沫箱中的水，替換成濃度為0.6%NaCl溶液（通過多年的研究發現，NaCl濃度過低，處理后蓮藕植株的表型變化不明顯，濃度過高，植株全部死亡，0.6%NaCl溶液恰好能夠區分蓮藕的耐鹽能力），體積為20 L，此后每天觀察記錄長勢，第5天進行鹽害指數調查，對照為等體積清水處理。為了進一步驗證蓮藕資源的耐鹽特性，同樣利用上述0.6%NaCl處理蓮藕資源，在第5天對每個蓮藕資源的葉和根進行隨機取樣，測定蓮藕資源的質膜相對透性、丙二醛、SOD和POD活性、根系活力及葉綠素含量（重復3次），通過計算隸屬函數值，區分蓮藕不同資源的耐鹽性。

1.2.2 測定指標及方法

1.2.2.1 不同蓮藕資源鹽害指數調查

利用0.6%NaCl處理蓮藕資源，之后5d內，每天觀察并統計蓮藕葉片形狀、顏色和受害癥狀。按照表1進行分級，然后根據如下公式計算鹽害指數：

1.2.2.2 生理指標的測定

葉綠素含量的測定參照李合生等[6]的方法。稱0.2 g研磨成粉的蓮藕葉片，加入裝有25 mL 95%乙醇的50 mL試管中，混勻后將試管放置于黑暗中2 h。652 nm波長下測定上清液的吸光值。試驗均采取3次重復。公式如下：

式中V為提取液總量，W為葉片鮮質量。

丙二醛含量的測定參照李合生等[6]的方法。稱取0.2 g在液氮狀態下研磨成粉的蓮藕葉片，加入2 mL 5%的三氯乙酸溶液后于震蕩器上充分混勻，12 000 r/min離心20 min，提取上清液。吸取1.0 mL離心的上清液，加入1.0 mL 0.6%硫代巴比妥酸（TBA）溶液，混勻于沸水浴上反應10 min，迅速冷卻后取上清液4 000 r/min離心10 min。于450 、532、600 nm波長下測定上清液吸光值。試驗均采取3次重復。公式如下：

式中，VT為提取液體積，V1為測定用提取液體積，G為材料鮮質量。

SOD活性的測定參照張志良等[7]的方法。稱取0.3 g在液氮狀態下研磨成粉的蓮藕葉片，加入2 mL磷酸緩沖液，緩沖液的pH值為7.8。12 000 r/min 4 ℃離心20 min，提取上清液，并于低溫保存備用。在10 mL離心管中加入2 mL磷酸緩沖液、104 mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液0.5 mL、300 umol/L氮藍四唑（NBT）溶液 1 mL、0.8 mol/L EDTA-2Na溶液0.5 mL、320 umol/L核黃素50 uL、上清液50 uL；對照管加磷酸緩沖液。混勻后將一支對照管置暗處作空白對照，利用4 000 lx的熒光燈照射其余各管30 min，待各管溶液顏色變黑褐后，用黑紙遮光終止反應。以不照光的對照管為空白對照，在560 nm波長下比色測OD值，試驗均采取3次重復。公式如下：

式中，ACK為光照下對照管的吸光值；AE為樣品管的吸光度；V為樣品液總體積；VT為測定時樣品用量；W為樣品鮮質量。

POD活性的測定按表2加入各種試劑。在樣品管中加10 uL 0.04 mol/L過氧化氫溶液，立刻搖勻，在470 nm處測OD值，讀出第2分鐘、第3分鐘的OD值。公式如下：

式中，A470為反應期間某時刻的吸光度值；△A470為反應時間內吸光度值的變化；W為樣品鮮質量；t為反應時間；VT為提取酶液總體積；Vs為酶液用量。

表1 蓮藕鹽處理后葉片受害分級

表2 各試管中需要加入試劑的量mL

根系活力測定參照張志良等[7]的方法。在稱量皿中加入0.8 g蓮藕根樣品，加入10 mL 0.4%氯代三苯基四氮唑（TTC）溶液和磷酸緩沖液的等量混合液，讓根充分浸沒在溶液內，于37 ℃下暗保溫2 h后再加入2 mL濃度為1 mol/L的硫酸，以停止反應。對照處理先加硫酸，后加樣品，其他操作同上。在20 mL試管中加入吸干水分的根，并加10 mL甲醇，密封放于避光處靜置2 h，待根變為白色時，在波長485 nm分光光度計下比色，以空白對照作參數測出吸光度，四氮唑還原量表示根系活力強弱，試驗均采取3次重復。公式如下：

質膜相對透性參照張志良等[7]的方法。用無離子水洗凈0.2 g鮮樣葉片，剪碎放入已加入20 mL無離子水的50 mL試管，振蕩30 min后于室溫下靜置30 min，用DDBJ-350型電導率儀測定溶液的電導率E1。然后將試管放置于沸水浴中10 min，冷卻后測定溶液總電導率E2，以無離子水電導率E0為參照，按以下公式計算質膜相對透性（P），試驗均采取3次重復。公式如下：

1.2.3 耐鹽性綜合評價

通過隸屬函數分析法，在上述0.6%NaCl處理蓮藕資源5 d內的生理指標（鹽害指數、葉綠素含量、丙二醛含量、SOD活性、POD活性、根系活力及質膜相對透性）測定的基礎上，全面評價了7種蓮藕資源的耐鹽特性。公式如下：

式中，X(μ1)和X（μ2）分別為正負相關指標的隸屬函數值；X為上述指標測定值，Xmin為測定指標的最小值，Xmax為測定指標的最大值。

通過加權葉綠素含量、丙二醛含量、SOD活性、POD活性、根系活力及質膜相對透性指標的隸屬函數值，最后計算出平均值，具體詳見彭振等[8]方法。鹽害指數隸屬函數值為X（μ11），質膜相對透性隸屬函數值為X（μ12），葉綠素含量隸屬函數值為X（μ13），根系活力隸屬函數值為X（μ14），過氧化物酶隸屬函數為X（μ15），超氧化物歧化酶隸屬函數為X（μ16），丙二醛隸屬函數值為X（μ21）。

1.2.4 數據分析

試驗數據均采用SPSS 16.0軟件中One-Way ANOVA分析Duncan法（P＜0.05）進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同蓮藕資源在NaCl處理下形態和生理指標的變化

2.1.1 不同蓮藕資源在NaCl處理下的鹽害指數

據觀察，0.6%NaCl溶液處理2 d內，蓮藕材料外觀形態上沒有發生明顯鹽害現象。由圖1可知，處理5 d后，植株葉片開始萎蔫，表現出不同程度的鹽害，其中H5、H8長勢較好，受到鹽害影響較輕，新葉能夠正常展開；H2和E3受傷害程度最大，大部分葉片失水干枯、皺縮卷曲，新葉不能正常開展，畸形扭曲，葉片發黃，并生有黑斑。由圖2可知，蓮藕材料在0.6%NaCl溶液處理第5天，H2受到鹽害影響程度最大，與其他蓮藕材料的鹽害指數有顯著差異；E1、E2、E3、E4受到鹽害影響程度處于中間值，而H5和H8受鹽害影響程度比較低，其中H5蓮藕材料鹽害指數最低，說明鹽脅迫下，H5耐鹽能力最強，而H2耐鹽能力最差。

2.1.2 不同蓮藕資源在NaCl處理下的葉綠素含量

圖3表明，各種蓮藕材料在0.6%NaCl溶液處理后葉綠素含量存在差異，其中，E1含量最低，與其他材料葉綠素含量差異顯著，表明耐鹽性最低。H2和E3葉綠素含量相同，均為0.16%，差異不顯著，且H2、E3和E1葉綠素含量均較低，表明H2、E3和E1受鹽脅迫后導致光合作用下降，葉綠素含量減少嚴重。E2、E4、H5和H8葉綠素含量較高，表明耐鹽性相對較強。

2.1.3 不同蓮藕資源在NaCl處理下的質膜相對透性

由圖4可知，0.6%NaCl溶液處理后H2質膜相對透性最高，高達45.01%，但與質膜相對透性為40.89%的E3差異不顯著，顯著高于其他蓮藕資源，說明鹽脅迫對H2和E3葉片傷害程度較大，H2和E3耐鹽性較差；H8質膜相對透性最低，且與E1、H5差異不顯著，說明這3種蓮藕受到鹽脅迫傷害相對較小，耐鹽能力較高。

2.1.4 不同蓮藕資源在NaCl處理下的根系活力

根系活力作為衡量根系抵御逆境能力的重要生理指標，能夠反映出植株耐鹽能力。由圖5可知，蓮藕材料受0.6%NaCl處理后H5的根系活力最高，為128.80 mg/（g·h），且與其他材料根系活力之間差異顯著；E3根系活力最低，為34.76 mg/（g·h），但與蓮藕材料E1、E2、E4、H2之間差異不顯著；H8根系活力僅次于H5，但與H2之間差異不顯著。

圖1 NaCl處理對蓮藕生長的影響

圖2 不同蓮藕資源在NaCl處理下的鹽害指數

圖3 不同蓮藕資源在NaCl處理下的葉綠素含量

圖4 不同蓮藕資源在NaCl處理下的質膜相對透性

2.1.5 不同蓮藕資源在NaCl處理下的丙二醛含量

丙二醛（MDA）是膜脂過氧化最重要的產物之一，它的產生還能加劇膜的損傷；因此，在植物衰老生理和抗性生理研究中MDA含量是一個常用指標，可通過MDA了解膜脂過氧化的程度，以間接測定膜系統受損程度以及植物的抗逆性。圖6表明，蓮藕資源受鹽脅迫后，E4的MDA含量最高，并且顯著高于其他蓮藕資源，說明E4受到的損傷最高，耐鹽性最差；H5的MDA含量最低，但與其他蓮藕材料MDA含量之間差異不顯著。

2.1.6 不同蓮藕資源在NaCl處理下的POD和SOD含量

圖5 不同蓮藕資源在NaCl處理下的根系活力

圖6 不同蓮藕資源在NaCl處理下的丙二醛含量

SOD、POD是重要的保護酶，可以有效地清除膜脂過氧化物對細胞造成的傷害。由圖7可知，0.6%NaCl處理5 d后，E1、E3的POD活性較低，僅為60.93 、29.39 U/（g·min），二者之間差異不顯著；H5的POD活性最高，為1 151.62 U/（g·min），但與POD活性為795.70 U/（g·min）的H8之間差異不顯著。H5和H8與其他蓮藕資源POD活性存在顯著差異。由圖8可知，E1的SOD活性最高，E1、H5、E2和H2的SOD活性差異不顯著，但高于其他蓮藕材料；蓮藕材料E4的SOD活性最低。

2.2 蓮藕資源耐鹽性綜合評價

采用隸屬函數法對蓮藕資源耐鹽性進行分析，得到的單一指標的隸屬函數值與最終的平均隸屬函數值排序并不完全一致，說明單一指標不能準確反映出蓮藕耐鹽能力（表3）。7份蓮藕資源耐鹽能力差異明顯，順序依次是：H5＞H8＞E2＞E4（E1）＞E3＞H2。H5、H8品種耐鹽能力相對較強，E1、E2、E4品種耐鹽性相對中等，E3和H2品種耐鹽性相對較弱。

3 結論與討論

植物耐鹽資源一般通過種子萌發期、苗期表現及產量進行篩選，需要綜合評價植物全生育期生理數據和終產量才更可靠[9]。由于蓮藕繁殖多為無性繁殖，且蓮藕種子多為雜合，所以利用種子萌發期和最終產量評價試驗蓮藕資源難以實施，因此本試驗在蓮藕苗期進行了資源篩選。

圖7 不同蓮藕資源在NaCl處理下的POD活性

圖8 不同蓮藕資源在NaCl處理下的SOD活性

表3 蓮藕資源耐鹽性隸屬函數與綜合評判結果

熊雪等[10-11]研究不同紫花苜蓿品種在鹽脅迫下的耐鹽性，以電導率、丙二醛、葉綠素、脯氨酸含量、根系活力等作為耐鹽性鑒定指標，再通過隸屬函數法對6個紫花苜蓿品種在不同濃度鹽脅迫下的耐鹽性進行綜合評價。本試驗對蓮藕材料的鹽害指數、丙二醛、根系活力、葉綠素、細胞質膜相對透性和抗氧化酶等指標綜合分析后，發現鹽害指數大小與耐鹽性綜合評價基本一致，該指標可以作為蓮藕耐鹽性分析的重要單項指標之一。茄子在不同濃度鹽脅迫下，隨著脅迫濃度的增加，光合速率呈現下降趨勢，葉綠體結構損傷引起非氣孔限制[12]。用5種不同濃度NaCl處理辣椒發現與對照相比，隨著NaCl濃度的增加，辣椒質膜系統受損，細胞質膜透性不斷增加，電解質外滲，電導率升高[13]。本試驗研究結果發現，蓮藕材料受到鹽脅迫后，H2和E1葉綠素含量最低，葉片受到的鹽害最嚴重，生長發育受到抑制，這與前人研究結果基本一致；因此葉綠素和質膜相對透性可以作為鑒定植物耐鹽性的指標。MDA是膜脂過氧化最重要的產物之一，是評價生物膜受損程度的一個重要指標。壇紫菜葉狀體受不同濃度鹽脅迫后，低濃度鹽脅迫下壇紫菜葉狀體的氧化損傷要顯著高于高濃度鹽脅迫，說明其含量與植物耐鹽性呈負相關[14]。本試驗中，蓮藕受鹽脅迫后，E4中MDA含量最高，與其他6個蓮藕材料的MDA含量差異顯著，而其他6個蓮藕材料MDA含量差異不顯著。邢建宏等[15]利用低中高3種不同的鹽濃度處理秋茄根系，分析其根系活力，發現隨著鹽濃度的增加，秋茄根系活力呈現下降趨勢，對秋茄的生長發育起到抑制作用。蓮藕材料中H5根系活力最高，與其他根系活力有顯著性差異，說明根系活力強弱可以體現植物的耐鹽性強弱。

植物的生理生化和形態指標在受到鹽脅迫后會發生一系列變化，通常單一指標難以準確反映植物耐鹽性，但利用隸屬函數法可以準確評價菊芋[16]、甜高粱[17]、茄子[18]和水稻[19]等植物的耐鹽性。利用0.6%NaCl溶液處理后，蓮藕資源的鹽害指數、葉綠素、丙二醛、抗氧化酶活性及根系活力指標差異較大，其中E1葉綠素含量最低，說明E1受到的鹽害最大，耐鹽性最差；E4的MDA含量最高，并且顯著高于其他蓮藕資源，說明E4受到的損傷最高，耐鹽性最差；E2受到鹽脅迫后葉綠素含量最高，但MDA含量不是最高，表明單一指標難以準確評價蓮藕材料的耐鹽性。