卵母細胞成熟比例對卵胞漿內單精子注射助孕療效的影響

楊冬宇，陳旭龍，謝妍，曹曉靜，李思楠，周文，袁啟龍，陸杉

（廣東省中醫院 生殖醫學科，廣東 廣州 510006）

控制性超促排卵技術是以藥物的手段，在可控制的范圍內誘發多卵泡的發育和成熟，以獲取適當數量的成熟卵母細胞[1]。目前促排卵方案包括短方案、長方案、超長方案及拮抗劑方案等[2-3]。廣義上卵母細胞的成熟應包括細胞核與細胞質同時成熟，成熟卵母細胞比例體現本周期獲取卵母細胞整體的成熟度水平[4-5]。本研究擬研究不同卵母細胞成熟比例對患者胚胎質量及臨床妊娠結局的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年6月—2017年12月于廣東省中醫院生殖醫學科接受卵胞漿內單精子注射（intracytoplasmic sperm injection, ICSI）治療的患者194例。納入標準：①因男方因素首次接受ICSI治療；②年齡≤35歲；③采用長方案行促排卵治療；④獲得卵母細胞數目≥3枚。排除標準：①移植前基因診斷或胚胎植入前遺傳學篩查患者；②卵母細胞成熟比例≤10%。

根據不同的卵母細胞成熟度將患者分為A、B組，分別有107和87例。A組為成熟卵母細胞數占獲卵數比例≥80%，且有移植胚胎的ICSI周期；B組為成熟卵母細胞占獲取卵母細胞數＜80%，且有移植胚胎的ICSI周期。

1.2 卵母細胞采集

采用標準長方案進行卵巢刺激，B超監測卵泡生長發育。當有主導卵泡直徑滿足3種情況之一（≥19 mm、2個≥18 mm及3個≥17 mm）時，結合性激素的檢查結果，使用人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin, HCG）扳機，當晚注射HCG 5 000～10 000 IU，HCG注射后36 h行B超引導下經陰道穿刺取卵。獲取的卵冠丘復合物經G-MOPs plus培養液（瑞典Vitrolife公司）洗滌后，轉入經平衡過的IVF plus培養液（瑞典Vitrolife公司）中繼續培養。

1.3 ICSI

卵冠丘復合物繼續在IVF plus培養液中預培養4 h（HCG注射后40 h），用透明質酸酶（瑞典Vitrolife公司）消化顆粒細胞，用巴斯德吸管小心謹慎的吹打卵母細胞2、3次，使卵丘顆粒細胞大部分脫離，僅留下2、3層顆粒細胞在卵母細胞周圍，在透明質酸酶中處理的時間≤30 s。將部分裸化的卵母細胞轉移到沖洗孔中，盡量少吸透明質酸酶液；改用內徑170μm的微吸管吹吸卵母細胞2、3次，盡量除去顆粒細胞；換用內徑約140μm的微吸管在右上、右下2個沖洗孔中吹吸卵母細胞，最后將裸化的卵母細胞移入G-IVFplus培養液（瑞典Vitrolife公司），置于37℃、6%二氧化碳CO2培養箱中培養。重復以上操作直至所有卵母細胞完全裸化，取去除顆粒細胞的卵母細胞在倒置顯微鏡下觀察卵母細胞成熟情況。①生發泡期：細胞核結構尚未消失，卵胞漿內可見核結構；②第1次減數分裂中期：細胞核結構消失，第1極體尚未排出；③第2次減數分裂中期（metaphaseⅡ, MⅡ）即成熟卵母細胞：細胞核結構消失，第1極體已排出。挑選形態正常的精子對處于MⅡ期卵母細胞行ICSI，將注射后的卵母細胞轉移至平衡好的G1 plus序貫培養液（瑞典Vitrolife公司）中繼續培養。

1.4 受精及胚胎質量評估

ICSI注射后18～20 h通過倒置顯微觀察原核，判定受精情況，以觀察到2個原核判定為正常受精。分別于ICSI注射后44和68 h觀察胚胎情況，根據胚胎碎片段多少及卵裂球均勻度等形態學指標對胚胎進行評分。1級：胚胎卵裂球大小均勻，形態規則，透明帶完整，胞質均勻、清晰沒有顆粒現象，碎片＜10%。2級：胚胎卵裂球大小略不均勻，形態略不規則，胞質可有顆粒現象，碎片10%～＜20%。3級：胚胎卵裂球大小明顯不均勻，可有明顯的形狀不規則，胞質可有明顯的顆粒現象，碎片20%～＜50%。4級：胚胎卵裂球大小嚴重不均勻，胞質可有嚴重的顆粒現象，碎片≥50%。其中細胞碎片＜10%、無其他異常現象的胚胎定義為優質胚胎。

1.5 胚胎移植及臨床妊娠結局判定

胚胎發育至第3天選取可利用胚胎進行胚胎移植。臨床醫生在胚胎學家的協助下，將胚胎放置于距子宮底約0.5～1.0 cm處。移植術后第12～14天進行隨訪，妊娠者繼續黃體支持治療，移植術后的第28～35天行B超檢查，觀察到胎心搏動確定為臨床妊娠。

1.6 統計學方法

數據分析采用SPSS 18.0統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗；計數資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者基本資料比較

兩組患者男女性年齡、體重指數（body mass index, BMI）、基礎竇卵泡（Antralfolliclecount, AFC）、不孕年限、基礎卵泡刺激素（basal follicle-stimulating hormone, bFSH）、基礎黃體生成素（basal luteinizing hormone, bLH）、基礎雌性激素（basal estrogen, bE2）及睪丸/附睪精ICSI比例比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。見表1。

2.2 兩組患者助孕情況比較

兩組患者大卵泡數、獲卵率、促性腺激素（Gonadotrophin, Gn）使用天數、Gn總劑量、HCG日子宮內膜厚度、可利用胚胎數、優質胚胎數、移植胚胎數、臨床妊娠率、胚胎著床率及自然流產率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。兩組患者小卵泡數、平均獲卵數、ICSI受精率及卵裂率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；A組小卵胞數、平均獲卵數少于B組，ICSI受精率、卵裂率高于B組。見表2。

表1 兩組患者基本資料比較

表2 兩組患者助孕情況比較

3 討論

卵泡的成熟受到很多因素的影響，如Gn總劑量、Gn使用時間、促排卵方案的選擇、患者的身體條件差異、卵泡發育速度、扳機方案及扳機劑量等[6-7]。本研究中B組患者的平均獲卵數多于A組，因兩組患者大卵泡數及獲卵率無差異，而B組平均穿刺小卵泡數多于A組，分析B組獲卵數多于A組是由于B組患者平均穿刺小卵泡數多于A組所致。

臨床上理想的促排結果是所有目標卵泡都達到同步狀態，在合適的時機獲取成熟的卵母細胞，但仍有部分卵泡發育遲緩或發育過快，致使卵泡發育不同步[8]。卵母細胞成熟應為細胞膜、細胞質、細胞核、卵丘細胞及透明帶的同步成熟，該成熟路徑經歷復雜的生物學過程[9]。在日常工作中，胚胎學家只能通過顯微鏡觀察卵母細胞第1極體的釋放情況來判定其成熟與否，卻無法獲悉細胞質是否也達到成熟狀態，而只有細胞質完全成熟時才能提供充足的能量及優質的代謝環境，保證卵母細胞正常受精及分裂，為胚胎正常發育提供條件。本研究中在B組獲卵數多于A組的情況下，兩組患者的平均可利用胚胎數和優質胚胎數無差異，說明A組的卵母細胞利用率更高，但兩者的臨床妊娠率、著床率無差異。兩組患者自然流產率無差異，但由于移植周期數較少，且B組的流產率具有增高的趨勢，有待驗證是否由于卵母細胞成熟度過低從而導致胚胎發育潛能不足。蔣益群[10]和付蕾等[11]的研究結果，表明ICSI不成熟卵母細胞比例過高可能對受精率、正常受精率、臨床妊娠率及種植率產生影響。結合本研究結果可以推測，隨著未成熟卵母細胞比例升高，整個獲取的卵母細胞成熟度偏低，對胚胎的發育潛能及臨床結局影響增加。

目前針對未成熟卵母細胞比例較高的患者采用卵母細胞體外培養（in-vitro maturation, IVM）的治療方式，對未成熟卵母細胞進行IVM以達到提高卵母細胞利用率的目的。通過IVM培養獲取的胚胎預后仍不理想，尤其是體外成熟的卵母細胞非整倍體增加，最好對通過IVM技術獲得的胚胎進行種植前遺傳學診斷篩選[12-13]。

相信隨著促排方案的逐漸優化和IVM技術的發展，卵母細胞成熟比例將會達到令人滿意水平，患者的卵母細胞利用率也會升高，從而獲取更多可利用胚胎以達到滿意的療效。