多組織對照體系建立及在免疫組化染色的應用

陳培瓊 鐘山 王玉環

隨著精準醫療的來臨，免疫組化已成為病理醫生重要輔助診斷手段[1]，在病理診斷中的作用日益廣泛。如今，免疫組化技術不僅用于協助腫瘤組織學分類的診斷、腫瘤來源的確定，而且還越來越多的作為判斷預后及指導臨床個性化治療的指標[2-3]。因此免疫組化染色的可靠性、正確性、穩定性至關重要[4]。免疫組化的染色過程較復雜，很多因素可對染色結果產生不同程度的影響。因此，需要建立合格的實驗對照。目前病理科常用的實驗對照有幾種形式：（1）單組織對照；（2）組織芯片對照；（3）“香腸技術”的多組織對照；（4）樣本中的內對照。作者在日常免疫組化染色工作中總結了上述幾種形式對照的利弊，摸索出了多組織對照方法，并建立多組織對照體系，取得了令人滿意的效果。現介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料

選取本院各臨床科室送檢的闌尾、結腸、胰腺、肺、甲狀腺、胎盤、扁桃體、腦、皮膚等組織，10%中性福爾馬林固定，按照常規組織的脫水，浸蠟和包埋，選取病理診斷明確的剩余的組織蠟塊進行實驗。

1.2 多組織對照體系的構建

結合日常工作中各抗體使用頻率、組織獲取難易度等因素，多次調整優化組合，設計了4組多組織對照體系（見表1），覆蓋面廣，涵蓋多種抗體，以達到組織耗費少、操作簡便、對照效果好的目的。

1.3 多組織對照蠟塊制備前準備工作

取材蠟塊先經過HE染色，鏡下觀察組織形態，選取部位，例如：肺組織應含有正常肺泡結構，扁桃體組織應含被覆鱗狀上皮及淋巴小結等。將HE片上符合要求部位作標記，然后比對蠟塊圈出相應部位。

1.4 多組織對照蠟塊制備

選取上述經過畫圈標記的組織蠟塊，放65℃烤箱5分鐘，軟化蠟塊，采用多組織對照點樣器（見圖1A）進行取材，該點樣器由作者自行設計，不銹鋼定制加工而成。多組織對照點樣器的針頭垂直在蠟塊上加壓，拔出點樣器、用內芯推出所取樣組織。所取組織外觀圓形條狀，直徑3 mm。3～5個組織一起包埋（類似包埋小標本），制成多組織對照蠟塊（見圖1B）。

1.5 多組織對照切片制備、染色

對多組織對照蠟塊進行連續地切片，裱于干凈的防脫載玻片上端，標明對照體系的類型，將待測組織切片后裱于下端，兩者距離適中。65℃烘烤1 h后上機，進行免疫組織化學染色。

2 結果

陽性對照染色理想，不同抗體在不同組織中具有不同定位及染色強度，由于在同一張玻片進行所有染色，便于讀片醫生做出更可靠的判斷。

4組多組織對照體系的建立，經多次驗證可為我科160多種抗體提供穩定可靠的陰陽性組織對照片，基本滿足工作需要。

4組體系基本滿足常用臨床診斷抗體質控，每種抗體加了對照片，在日常的質控中，就易發現實驗是否成功，并找出假陰性或假陽性的原因。圖2、圖3（多組織對照免疫組織化學染色舉例）。

3 討論

為保證病理診斷中免疫組化結果的可靠性，每種抗體每張切片的染色都應進行有效的質控，設立穩定的對照并合理運用是質控的關鍵[5]。免疫組化染色的對照包括陽性組織對照、陰性組織對照、陰性試劑對照、內對照[6]。其中，陰性試劑對照是針對內源性生物素設立的，一旦完成試劑最初校驗，就可以取消陰性試劑對照[7]。本文所介紹的多組織對照囊括了陽性組織對照、陰性組織對照及內對照。內對照又包括內部陰陽性對照，是每一張被測試的組織切片上都存在的細胞成份，可確認組織固定、包埋步驟的可靠性。在免疫組化染色中使用對照是保證質控的最有效的方法[8]。

表1 多組織對照各點組織的抗體陽性表達對照情況

圖1 1A是多組織對照點樣器 ；1B是多組織對照蠟塊；圖2 2A為扁桃體組織的CD3 細胞膜陽性（4×10）；2B為扁桃體組織的 Ki67細胞核陽性（4×10） ；圖3 3A為扁桃體組織的CK5/6 細胞質陽性（4×10）；3B為皮膚組織的P63細胞核陽性（10×10）

作者發現單組織對照[8]制作簡單，雖組織獲取方便，但由于標記覆蓋面不夠廣，常需要準備大量用于各種標記類型的組織蠟塊，對于不常用的組化，常是醫生覺得有需要時提出加對照，技術員臨時制作，查片、閱片、找蠟塊耗費時間巨大。并且單組織對照蠟塊常使用已知抗原表達較強的組織，相對于抗原表達較弱的檢測組織就容易產生假陰性。組織芯片對照[9]抗體覆蓋面最廣，且高通量，但制作起來需要專門的儀器，對制作過程要求高，包埋易形成空泡，由于組織量小、細胞數量少，大量連續切片陽性率不穩定，同一平面常無法切全。平常工作中片子很多，動輒上千張，應用起來成本巨大，難以推廣到日常，一般用于科研。香腸技術是運用多種組織制作香腸包埋塊陽性對照切片[10]，效果較好，但對照組織面積大，消耗試劑多，要從取材固定開始做起，制作過程煩瑣。

現今，全自動免疫組化儀[11]普及，對技術人員提出更高要求：要為機器設定最佳的染色程序。在實驗過程中作者無法觀察到染色的全過程，而此過程中可能出現滴加抗體量不足、混勻不均，沖洗不凈、出現氣泡、溫度下降等現象，會影響實驗結果的準確性。因此作者設計了多組織對照點樣器，建立多組織對照體系，制作多組織對照蠟塊，對整個染色流程及機器嚴格精確把控，為病理診斷提供高質量的免疫組化染色片，確保染色結果可靠穩定。現總結如下：

（1）多組織對照與待測組織在同一張切片上進行染色，實現了實驗條件的一致性，同時有陰陽性對照，染色結果可靠、準確，為免疫組化染色的規范化、標準化奠定基礎。切片也可直接歸檔保存，不需要單獨保存陽性對照切片。

（2）多組織對照分組的設計靈活多變，可根據不同需要設計出不同的多組織對照體系。一般選擇三五個對照組織，兼具抗體覆蓋面和實際操作，更為方便。 對大量抗體進行檢測時可避免假陰性、假陽性的風險。

（3）用多組織照點樣器取樣，簡便易行。所取蠟塊也是病理診斷明確的剩余組織蠟塊，與待測組織的前處理一致。此外多組織點樣器內徑大，所取組織直徑3 mm，大于組織芯片，可提高了取樣的準確性、便于組織包埋，特別利于腫瘤與正常組織交界處的取樣、方便醫生閱片。此外通過對多組織對照表達情況的觀察，可能會發現一些抗體在不同組織上的應用。

綜上，多組織對照點樣器設計簡單，成本低廉，容易操作，經過合理設計的多組織對照體系耗費少、實用性強、效益性高、可操作性和重復性好，質量可靠穩定，可推廣至病理科日常工作中，運用于免疫組化染色質控中，為室內及室間質量控制帶來穩定、便利，提高了整個免疫組化染色技術的質控水平。