“醒腦開竅”針刺法對腦缺血再灌注大鼠海馬神經元KATP通道細胞電生理的調控研究*

韓 林 ，高 旸 ，王旭慧 ，張亞男 ，王 舒

（1．天津中醫藥大學第一附屬醫院針灸部，天津 300193；2．天津中醫藥大學第一附屬醫院針灸研究所，天津 300193）

腦缺血后一定時間內恢復血流，組織損傷和功能障礙反而加重，甚至導致不可逆轉性損傷，被稱為腦缺血再灌注損傷，腦缺血再灌注損傷是多種腦血管疾病的誘因，其發生機制目前尚未完全闡明[1]。針刺對抗腦缺血再灌注損傷療效肯定。針刺基于傳統經絡學說，以多重作用、多靶點的方式發揮遍及全身的整體治療效應。這些效應作為一種典型的生物信息傳遞包含各種細胞電生理及生物化學改變。研究發現，三磷酸腺苷敏感性鉀通道（KATP）可能作為重要的作用靶點參與了腦缺血再灌注損傷的病理過程[2-3]。在腦組織低氧或缺血性損傷時，KATP通道開放可使神經元興奮性降低，減少神經元的損傷和蛻變[4]。但針刺是否通過調節KATP通道對抗腦缺血再灌注損傷的作用機制目前尚不明確。本研究將采用膜片鉗技術觀測“醒腦開竅”針刺法對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠（MCAO/R）海馬神經元KATP通道電生理特性的影響，從離子通道角度探討針刺對抗腦缺血再灌注損傷的作用機制。

1 資料與方法

1.1 實驗動物及分組 雄性Wistar大鼠（SPF級）32只，體質量150～200 g，周齡4～6周。由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物生產許可證編號：SCXK（京）2016-0011。實驗動物按照隨機數字表法分為空白組、假手術組、模型組、電針組，每組8只大鼠。實驗動物于二級動物房喂養，室溫（20～25℃），光照時間（07：00～19：00）自由攝食、飲水。所有實驗過程均遵循中華人民共和國科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2 主要試劑及溶液 鏈霉蛋白酶XIV（批號：SLBJ2160V）、格列苯脲（批號：075K1376）、羥乙基磺酸鈉（批號：MKBH0413V）均購自美國Sigma公司。主要溶液：1）高滲透蔗糖溶液（HSS）（mmol/L）：Sucrose 234，KCl 2．5，Na2HPO41，CaCl20．1，HEPES 15，GLUCOSE 11，MgSO44（pH7．3 with NaOH）。2）羥乙基磺酸鈉溶液（HSSB）（mmol/L）：羥乙基磺酸鈉132，KCl 2，CaCl20．1，MgCl24，HEPES 15，GLUCOSE 23（pH7．3 with NaOH）。3）Earle's平衡的鹽溶液（EBSS）（mmol/L）：NaHCO326，CaCl21．8，MgSO40．8，KCl 5．35，NaCl 116，NaH2PO41，GLUCOSE 5．56，酚紅 0．003（pH7．3 with NaOH）。4）Hanks平衡鹽溶液（HBSS）（mmol/L）：KCl 5．37，KH2PO40．441，NaCl 137，Na2HPO40．34，HEPES 11，酚紅 0．003，MgCl24，GLUCOSE 5．56，CaCl21（pH7．3 with NaOH）。5）細胞浴液（mmol/L）：KCl 140，HEPES 10，EGTA 2（pH7．3 with KOH）。6）微電極內液：KCl 140，CaCl21，MgCl20．5，HEPES 10（pH7．3 with KOH）。以上試劑均采用國產優質分析純，以去離子水配制而成。

1.3 儀器設備 膜片鉗放大器（HEKA EPC-10德國），數據采集軟件 Patchmaster（HEKA，德國），數據分析軟件 Fitmaster（HEKA，德國），程控玻璃微電極拉制儀（P-97型，美國），振動切片機（World Precision Instruments MA752-04，美國），微電極操縱器（MP-285/R，美國），倒置顯微鏡（Nikon Ti-S，日本），韓氏神經穴位刺激儀HANS-200E購自南京濟生醫療科技有限公司。

1.4 模型制作 模型組、電針組每組各8只大鼠參照ZeaLonga線栓法并加以改進[5]，制作大腦中動脈缺血再灌注模型。大鼠禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉（3 mL/kg）。頸部手術區域備皮、消毒，取頸部正中稍偏左切口1．5～2 cm，分離皮下筋膜，暴露左側胸鎖乳突肌和胸骨舌骨肌間的三角區，分離左側頸總動脈和頸外動脈，結扎頸外動脈，于頸總動脈分叉處遠心端和近心端分別用動脈夾夾閉，用1 mL注射器針頭在近心端血管壁穿刺，將直徑0．26 mm的尼龍線栓沿針孔緩慢插入（線栓尖端經細砂紙打磨圓頓、光滑），待線栓前段抵達分叉處，放開此處動脈夾，將線栓繼續送入頸內動脈，直至微遇阻力為止，線栓進入顱內深度為18～20 mm，插線成功后結扎頸總動脈，放開另一個動脈夾，分層縫合。假手術組僅分離頸總動脈及頸外動脈，不插入尼龍線栓。按Zausinger六分法[6]對神經功能進行評分，評分為0～5分，評分越低，神經功能缺損越嚴重。排除評分為0、4、5分及死亡動物，選擇評分為1、2、3分的大鼠進入下一階段實驗。

1.5 針刺選穴及干預方法 電針組8只大鼠于造模成功后針刺內關、水溝、三陰交；空白組、假手術組、模型組大鼠同樣抓取，但不給予針刺治療。根據中國針灸學會實驗針灸研究會制定的“動物針灸穴位圖譜”，并參考大鼠的解剖結構和體表標志，水溝位于鼻尖下1 mm唇裂正中，內關位于前肢內側，腕關節上約3 mm，尺、橈骨間隙中；三陰交位于后肢內踝尖直上1 cm。針具選用蘇州醫療用品廠生產的“華佗牌”毫針，長40 mm，直徑0．30 mm。電針儀選用韓氏神經穴位刺激儀HANS-200E（南京濟生醫療科技有限公司，產品標準編號為YZB/蘇0049-2008）。先直刺雙側內關穴1 mm至筋間，繼在鼻中隔下部向上45°斜刺人中穴1 mm，其次直刺患側三陰交穴3 mm，留針20 min；留針期間將患側內關穴、三陰交穴針柄分別連接至韓氏神經穴位刺激儀，施以疏密波，頻率2 Hz/15 Hz，電流1 mA。首次針刺在動物造模成功90 min后進行，每天針刺2次，每天10時、16時各針刺1次，共3 d。

1.6 海馬神經元的急性分離 治療結束后次日，各組大鼠以水合氯醛腹腔麻醉（3 mL/kg）后快速斷頭取腦，在0～4℃通以100%O2的HSS中冰凍2 min后用震動切片機將腦組織切成400 μm厚度的薄片；用HSSB漂洗腦片3次，在33℃通有95%O2和5%CO2混合氣體的Earle's平衡鹽溶液EBSS中孵育1．5 h；將腦片轉移到HSSB中，于解剖顯微鏡視野下剝離海馬組織CA1區，放入盛有鏈霉蛋白酶（Protease XIV 1．3 g/L）的Hanks平衡鹽溶液的容器中，通入100%O2，在33℃酶溶液中酶解30 min；將組織在HSSB溶液中漂洗3次，用Pasteur吸管按口徑由大到小的順序吹打，使組織分散（吸管尖端口徑分別為500、300、150 μm）；靜置后將中層液體滴入表面潔凈的蓋玻片上，待細胞貼壁后用正常浴液漂洗2次；加入2 mL細胞浴液，選取有明顯突起、邊界清楚、胞質均勻一致的錐體神經元進行記錄[7]。

1.7 單通道膜片鉗 記錄用P-97水平微電極拉制儀，采用兩步拉制法將硬質厚壁玻璃電極毛坯拉制成封接電極。電極尖端直徑0．5～1 μm。沖灌電極液以不超過電極長度的1/3為宜。充灌電極液后，電極入水電阻大約在5～8 MΩ之間。將記錄浴槽置于倒置顯微鏡下，以（400×）的放大倍數觀察細胞，選擇胞膜清晰、胞體透亮、胞質均勻，貼附良好的錐體細胞作為實驗對象。由膜片鉗放大器在±60 mV范圍內以20 mV為階躍輸出鉗制電壓，觀察通道電流活動。采樣時間為10 s，采樣間隔為5 s。玻璃微電極內插氯化銀電極與膜片鉗放大器（HEKA EPC-10德國）相連，放大器探頭反饋電阻為50 GΩ，低通濾波器濾波頻率為3 kHz。單通道電流以Patchmaster數據采集系統（HEKA，德國）采集入計算機，測量結果用Fitmaster軟件進行信號分析處理。采樣頻率為5 kHz，測量通道開關事件的時間分辨率為300 μs。

單通道事件的檢測采用50%閾值法，電流幅度通過對電流幅度直方圖進行Gaussian擬合獲得；平均開放時間通過對對數平方根直方圖采用Exponential log probabilitiy擬合獲得；開放概率以NPo表示，NPo是指在某一指令電壓條件下，鉗制膜片上所有通道總的開放概率，NPo=t0/t其中N：膜片上通道的數目；Po：指令電壓條件下，刺激時間內，正在開放的單個通道的開放概率；t0：每個sweep期間，單個通道的開放時間；t：指令電壓下，刺激持續總的時間。主要檢測指標：1）神經元形態觀測。2）+60 mV鉗制電壓下KATP通道電流幅度，開放時間，開放概率。

1.8 統計學方法 數據分析應用SPSS 21．0系統軟件，正態分布計量資料統計描述采用均數±標準差（±s）表示，治療前后比較采用配對t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間兩兩比較采用最小顯著差值法（LSD法），P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠神經功能評分比較 與本組治療前比較，電針組治療后神經功能評分明顯升高（P＜0．01）；與空白組、假手術組比較，模型組治療前、治療后神經功能評分均明顯降低（P＜0．01）；與模型組比較，電針組治療后神經功能評分明顯升高（P＜0．01）。見表1。

表1 各組大鼠神經功能評分比較（x±s）Tab.1 Comparison of neurological deficits scores of rats in each group（±s）

表1 各組大鼠神經功能評分比較（x±s）Tab.1 Comparison of neurological deficits scores of rats in each group（±s）

注：與治療前比較，**P＜0．01，與模型組比較，##P＜0．01。

組別 動物數 治療前 治療后空白組 8 5．00±0．00## 5．00±0．00##假手術組 8 5．00±0．00## 5．00±0．00##模型組 8 2．25±0．46 2．25±0．71電針組 8 2．13±0．35 3．38±0．74**##

2.2 神經元形態學觀察 倒置顯微鏡下對各組海馬組織急性分離所獲得的神經元進行觀測，并選擇形態完整，活性良好的神經元進行膜片鉗記錄。健康的神經元：胞體具有統一的亮視野，形狀為椎體或梭形，無暗斑，近端樹突結構保留，頂端日暈結構完整；死亡的神經元胞體為統一的暗視野，胞體充滿暗斑。不健康神經元胞體布有水泡，樹突呈串珠樣改變，胞膜模糊，胞體腫脹，胞漿有明顯的黑色顆粒。（圖 1，A-D）。

圖1 各組大鼠神經元形態學觀察Fig.1 Morphological observation of neurons in each group

2.3 KATP通道電生理特性 在對稱性高鉀浴液中（細胞浴液與電極內液K+濃度均為140 mmol/L），所記錄的KATP通道開放多呈簇狀和猝發樣，兩次開放之間常為較長時間的關閉狀態。KATP通道電流的幅度隨超極化或去極化程度加大而增大（圖2A），在同一鉗制電位下，通道電流幅度基本相同，呈波寬不等的矩形方波。細胞浴液內加入KATP通道特異性阻斷劑格列苯脲（Glybenclamide 0．1mmol/L）可基本阻斷KATP通道的開放（圖2B）。由電流-電壓關系曲線（I-V曲線）的斜率得出所記錄的單通道電導為80．1±7．6 pS（膜片數 n=8）（圖 2C）。

2.4 電針對各組大鼠海馬神經元KATP通道的影響 由于+60 mV鉗制電壓下所記錄的電流曲線基線平穩，噪音相對較少，通道開放穩定，故實驗對+60mV鉗制電壓下所記錄到的電流曲線進行擬合分析，各組隨機選取8個封接成功的膜片進行數據分析。與正常組比較，假手術組海馬CA1區神經元KATP通道電流幅度、開放時間、開放概率均無統計學差異（均 P＞0．05）；與正常組、假手術組比較，模型組開放時間、開放概率均明顯增大（P＜0．01），電流幅度無統計學差異（P＞0．05）；與模型組比較，電針組開放時間、開放概率明顯減小（P＜0．01），電流幅度無統計學差異（P＞0．05）。見表 2。

3 討論

圖2 KATP通道電生理特征Fig.2 Electrophysiological characteristics of KATPchannels

表2 +60 mV鉗制電壓下各組電流幅度、開放時間及開放概率比較（±s）Tab.2 Comparisonofcurrentamplitude，opentimeandopen probability under the holding potential of+60 mV(x±s)

表2 +60 mV鉗制電壓下各組電流幅度、開放時間及開放概率比較（±s）Tab.2 Comparisonofcurrentamplitude，opentimeandopen probability under the holding potential of+60 mV(x±s)

注：與模型組比較，*P＜0．01。

組別 膜片數 電流幅度（mV） 開放時間（ms） 開放概率正常組 8 5．02±2．41 1．45±0．51* 0．09±0．06*假手術組 8 6．33±1．31 1．65±0．56* 0．07±0．06*模型組 8 5．00±3．25 4．56±1．14 0．33±0．14電針組 8 6．27±0．93 1．51±0．95* 0．06±0．05*

“醒腦開竅”針刺法是石學敏院士創立的治療中風病行之有效的方法。多年來“醒腦開竅”針刺法廣泛應用于缺血性腦卒中的臨床治療，效果顯著。內關、水溝、三陰交為“醒腦開竅”針刺法主穴。內關為八脈交會穴，通陰維脈，為手厥陰心包經之絡穴，有寧心安神、疏通氣血之功；水溝為督脈與手、足陽明經之會穴，督脈起于胞中，上行入腦達巔，故針刺水溝可調督脈、開竅啟閉以醒腦安神；三陰交穴為肝、脾、腎三陰經的交會穴，能激發三陰氣血，達到養血安神之功。近年來，“醒腦開竅”針刺法干預腦缺血的實驗研究從細胞、亞細胞水平逐步深入到分子水平，其防治腦損傷的作用機制主要體現在改善神經缺損、提高細胞缺血后抗氧化能力、抑制缺血-再灌注損傷、改善腦供血等方面[8]。

ATP敏感性鉀通道是電壓非依賴性配體門控通道，由內向整流鉀通道和硫脲類受體（SUR）組成，是一組直接將細胞能量代謝和電活動相耦聯的重要通道，該通道廣泛分布于大腦各類神經元中，參與多種細胞功能調控。KATP通道開放使得K+外流，細胞膜超極化，細胞興奮性降低，這種超極化可以使細胞膜電位更接近于K+平衡電位。在腦缺血再灌注損傷中，KATP通道的開放可以穩定膜電位，避免神經元受到去極化和興奮性毒性造成的損傷[9]。KATP通道產生的內向整流鉀電流可以被細胞內ATP所抑制，當細胞內ATP/ADP比率升高，可使KATP通道關閉，引起細胞的去極化，而當細胞內ATP/ADP比率降低，可使KATP通道開放，引起細胞的超極化[10]。在生理條件下，由于腦組織細胞內ATP含量處于高水平，神經元KATP通道處于關閉狀態，而在缺氧缺血、缺血預適應或代謝抑制的病理條件下由于細胞內ATP/ADP比率降低，KATP通道則開放，通過使神經元膜電位超極化、降低神經元興奮性等途徑減少神經元損傷和退變[11]。

針刺抗腦組織缺氧缺血損傷作用已得到確證，它的作用可能與調節KATP通道開放相關。我們課題組之前的研究發現針刺可能通過KATP通道調節PI3K/Akt信號通路，從而減少腦缺血再灌注后細胞凋亡的發生[12]。Jiang等[13]以電針預處理新生缺氧缺血大鼠，發現電針可促進KATP通道開放，抑制電壓依賴性鈣通道開放，減輕Ca2+超載和減少興奮性神經遞質的釋放，降低核轉錄因子c-fos和c-jun蛋白的表達，抑制神經細胞凋亡發生。許靜等[14]以電針百會、大椎穴干預MCAO大鼠，結果發現針刺能使線粒體mito-KATP通道開放，減少線粒體內鈣釋放、維持缺血缺氧后線粒體的穩定性；減少細胞凋亡的發生，從而保護神經元。

目前從細胞電生理角度探討針刺對抗腦缺血作用機制的研究非常少見，這與神經元個體微小，很難在離體環境中存活有關。膜片鉗技術是在電壓鉗的基礎上發展而來的一種記錄細胞膜離子通道電生理活動的技術。發展至今，已成為現代細胞電生理研究的先進方法，為解決生物信息的跨膜信號轉導問題提供了先進的研究手段。膜片鉗技術可直接觀測到細胞膜離子通道的電學改變用以解釋針刺的細胞作用機制[15]。本項研究借助單細胞膜片鉗技術直接觀測“醒腦開竅”針刺法對MCAO/R大鼠海馬神經元KATP通道電生理特性的影響，結果發現：腦缺血再灌注后大鼠神經功能評分明顯下降，說明大鼠神經功能明顯受到損傷，而海馬椎體神經元KATP通道開放時間明顯延長、開放概率明顯增大，說明腦缺血再灌注損傷后海馬組織KATP通道開放活動明顯增加，腦組織通過調節KATP通道開放維持細胞能量代謝，降低神經元興奮性而發揮自我保護效應，這一發現與之前文獻報道相一致[16-17]。而電針“醒腦開竅”針刺法主穴后大鼠神經功能評分明顯升高，說明神經功能得到改善，而海馬神經元KATP通道開放時間、開放概率明顯降低，說明針刺有效的對抗了腦缺血再灌注損傷，起到維持神經元正常能量代謝的作用，使海馬神經元KATP通道開放活動趨于正常水平。另外，我們發現模型組、電針組海馬神經元KATP通道電流幅度較空白組、假手術組均無明顯差異，說明腦缺血再灌注損傷及針刺干預均未對KATP通道電流幅度產生影響。目前，本研究僅涉及造模后針刺的后處理效應，對于針刺的預處理是否可在腦缺血再灌注的病理過程中進一步激活KATP通道開放，以及隨著腦缺血再灌注病理損傷的出現，KATP通道開放的動態變化等問題將成為下一步研究關注的重點。