南方水稻黑條矮縮病抗性的遺傳分析及主效QTL的精細定位

農保選 秦碧霞 夏秀忠 楊行海 張宗瓊 曾宇 鄧國富 蔡健和 李戰彪 劉丕慶 李丹婷, *

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南方水稻黑條矮縮病抗性的遺傳分析及主效QTL的精細定位

農保選1, 2, 3秦碧霞4夏秀忠2, 3楊行海2, 3張宗瓊2, 3曾宇2, 3鄧國富2, 3蔡健和4李戰彪4劉丕慶1, *李丹婷2, 3, *

(1廣西大學 農學院, 南寧 530004;2廣西農業科學院 水稻研究所, 南寧 530007;3廣西水稻遺傳育種重點實驗室, 南寧 530007;4廣西農業科學院 植物保護研究所, 南寧 530007;*通訊聯系人, E-mail: liupq@gxu.edu.cn; ricegl@163.com)

【目的】近年來由白背飛虱傳播的南方水稻黑條矮縮病給水稻生產造成了巨大損失，開展該病的抗性遺傳分析和基因精細定位，將為抗性育種提供材料和理論依據。【方法】分析了抗性材料D4對南方水稻黑條矮縮病的抗性特征，并通過廣恢998/D4 F2群體分析該病抗性的遺傳規律，利用QTL-seq技術聯合遺傳連鎖分析定位主效抗性QTL。【結果】D4對南方水稻黑條矮縮病的抗性表現為抗病毒性而非抗蟲性，且受主效基因和微效基因共同控制。QTL-seq和連鎖分析將南方水稻黑條矮縮病主效抗性QTL定位于第9染色體上，命名為。利用代換作圖法進一步將定位在102.3 kb的區間內，該區間包含21個預測基因，其中9個基因與赤霉素信號傳導相關。【結論】揭示了D4對南方水稻黑條矮縮病的抗性特征及遺傳規律，精細定位了南方水稻黑條矮縮病主效抗性QTL。這為該QTL的圖位克隆及育種利用奠定了基礎。

南方水稻黑條矮縮病；白背飛虱；遺傳分析；QTL；精細定位

南方水稻黑條矮縮病是一種以白背飛虱為主要傳播介體的病毒性病害[1]，2001年首次被中國學者周國輝在廣東省陽西縣晚稻田中發現[2]。2008年，周國輝等[1]將南方水稻黑條矮縮病毒(, SRBSDV)鑒定為呼腸孤病毒科()斐濟病毒屬()的一個新種。SRBSDV由傳播媒介白背飛虱以持久增殖型方式傳播，病毒粒子由白背飛虱的口針吸食進入蟲體內，再通過白背飛虱的取食經唾液侵染水稻植株[3]。自21世紀初以來，該病害的發生給中國和越南北部等地區的水稻生產造成了極大的危害，局部地區嚴重暴發導致絕收[4-7]。水稻發病植株的典型癥狀為矮縮、葉色濃綠、葉鞘上有乳白色或黑褐色瘤狀凸起等[1]。與本病害不同，水稻黑條矮縮病是一種主要由灰飛虱(Fallén)傳播的水稻病毒病，雖然其病原與南方水稻黑條矮縮病同屬于斐濟屬病毒，兩者在癥狀、血清學、病毒粒體形態及基因組序列等方面非常相似[1, 2, 8-10]，但二者發病癥狀存在不同之處，“高節位分枝”和“倒生根”在水稻黑條矮縮病中較少出現。除此之外，二者在傳毒介體、發病范圍、發病規律、品種抗性及防治措施等方面均存在差異[1, 5, 7, 11-16]。目前，水稻生產上主要采取化學藥劑殺滅白背飛虱的辦法來防治南方水稻黑條矮縮病[5, 7, 13]。

培育抗病新品種，是控制各類病害最經濟有效、最環保的措施，而篩選新抗源、發掘抗病新基因是開展抗病育種的前提和基礎。當前對南方水稻黑條矮縮病的研究主要集中在病毒檢測[17, 18]、生物學特點[3, 19-21]、發生為害及綜合治理[22-26]等方面，關于抗性材料篩選的報道較少，篩選到的抗源有限。潘鳳英等[27]采用田間自然誘發鑒定方法，從19份水稻雄性不育系材料中篩選出1份高抗、3份中抗材料。劉琳琳[14]采用人工接種方法測定了24個水稻品種的南方水稻黑條矮縮病發病率，僅鑒定出3個中抗品種。秦碧霞等[16]采用人工接種方法對45份廣西主栽水稻品種和53份市場銷售的水稻品種進行南方水稻黑條矮縮病抗病性鑒定，結果顯示高感品種和中感品種分別占測試品種的97.96%和2.04%，未發現抗病品種，與田間實際表現基本吻合。余守武等[28]采用人工接種鑒定方法，從98份水稻中間材料中篩選到6份南方水稻黑條矮縮病抗性較好的光溫敏核不育系材料。迄今為止，對南方水稻黑條矮縮病抗性的遺傳研究還鮮見報道，尚無關于抗性基因或QTL定位的報道。

本研究分析了普通野生稻高代回交導入系D4的南方水稻黑條矮縮病抗性特征，對其抗性進行遺傳分析，并利用QTL-seq技術對南方水稻黑條矮縮病主效抗性QTL進行定位，通過遺傳連鎖分析驗證并精細定位該QTL。研究結果將為南方水稻黑條矮縮病的抗性育種提供新的基因資源，同時為該QTL的圖位克隆和功能研究奠定基礎。

1?材料與方法

1.1 供試材料

GW118為廣西普通野生稻材料，高抗南方水稻黑條矮縮病；廣恢998為三系雜交稻恢復系，感南方水稻黑條矮縮病。以廣恢998為受體，GW118為供體，構建了包含297個株系的高代回交導入系群體(BC3F4)，D4是該導入系群體中的一個高抗南方水稻黑條矮縮病株系。PTB33(抗蟲對照)及臺中在來一號(TN1)(感蟲對照和感病對照)由廣西農業科學院植物保護研究所水稻害蟲研究課題組提供。以D4(抗病親本)作為父本，廣恢998(感病親本)作為母本，經過雜交、自交，獲得包含5004個F2單株的遺傳分離群體。分別提取每個單株的DNA保存備用，同時，分別收獲每個F2單株的種子備用。

1.2 白背飛虱抗性鑒定

以排驅性和抗生性測驗鑒定水稻材料的白背飛虱抗性，參照Wang等[29]方法并稍加改動。抗蟲對照品種為PTB33(具排驅性和抗生性)、感蟲對照品種為TN1(無排驅性和抗生性)。將D4、廣恢998、TN1及PTB33的種子催芽露白后選取長勢均一的種子播于塑料盤(41 cm×34 cm×7 cm)，每份材料種植1行，每行10株，株行距為3 cm×8 cm，置于光照培養箱內培養(26℃±1℃，15 h光照/9 h黑暗)。于1.5~2.0葉齡期，按每株苗5頭蟲的總量接種2~3齡幼蟲，24 h后，于每天8：00、16：00兩次記錄落在每個單株上的蟲數，每次調查完成后驅蟲，使其盡可能均勻分布。5 d后計算每份材料每個單株上的平均蟲數，作為排驅性測驗值，植株上蟲量越少其排驅性越強。將D4、廣恢998、TN1及PTB33的種子催芽露白后，選取生長勢均一的種子播于直徑12 cm、高15.5 cm，并鋪有2 cm厚營養土的玻璃杯中，每份材料5株，置于光照培養箱內培養(26℃±1℃，15 h光照/9 h黑暗)。于1.5~2.0葉齡期，每杯接入20頭1~2齡幼蟲，紗網封口，于1、3、5、7 d后統計每個杯子剩余的蟲數，計算幼蟲的存活率，作為抗生性測驗值，蟲子存活率越低表示品種抗生性越強。

1.3 南方水稻黑條矮縮病的接種鑒定

水稻病株采自廣西三江縣(E108°99'，N25°57')，傳毒介體白背飛虱采自廣西南寧市西鄉塘區石埠鎮(E108°22'，N22°83')。人工接種參照秦碧霞等[16]方法，稍加改動，把健康低齡白背飛虱轉到水稻病株上飼毒2~3 d，再轉到健康TN1稻苗上，飼養10~12 d度過循回期后作為接種傳毒介體。在廣西農業科學院水稻研究所人工氣候室內進行接種，溫度為26℃~28℃，相對濕度為75%~90%，將待鑒定水稻材料種植在1 L的透明塑料杯中，每杯種植材料35株，于1.5~2.5葉齡期，淘汰弱苗，選取生長一致的30株幼苗進行接種，接蟲量為每株苗4頭蟲，每天8:00和16:00驅蟲兩次，保證鑒定材料均勻獲毒，傳毒2 d后將蟲轉移走，將已接種的水稻苗移植到防蟲網室或溫室，常規管理。接種20 d后調查每個品種的發病株數，之后每隔7 d調查1次，共調查3次，統計每個品種的發病率。重復3次，感病對照品種為TN1。發病率(%)=發病株數/總株數×100。抗性分級標準如下：0級，發病率為0.0%，免疫(I)；1級，發病率為0.1%～5.0%，高抗(HR)；2級，發病率為5.1%～30.0％，中抗(MR)；3級，發病率為30.1%～60.0％，中感(MS)；4級，發病率大于60.0％，高感(HS)。

1.4 全基因組重測序及分析

隨機選取357份廣恢998和D4衍生的F2:3株系進行人工接種鑒定后，根據鑒定結果，從F2群體中篩選出高抗(發病率不大于5.0%)和高感(大小于60.0%)的植株各50株，分單株提取等量DNA混勻，構建抗、感基因池用于全基因組重測序。文庫構建、測序、生物信息學分析參照Yang等[31]方法進行，SNP-index關聯分析參照Takagi等[32]方法進行。

1.5 QTL驗證及精細定位

以水稻品種日本晴基因組序列為參考序列，利用D4和廣恢998的全基因組重測序序列在第9染色體上的InDel信息，開發InDel標記。利用多態性InDel標記對F2群體的單株進行基因型分析，使用Join Map 4.0[33]進行連鎖分析，繪制連鎖遺傳圖，使用Map QTL 6.0[34]進行QTL掃描，利用重組單株進行精細定位。

2 結果與分析

2.1 D4對南方水稻黑條矮縮病和傳毒介體白背飛虱的抗性表現

人工接種結果顯示，D4的南方水稻黑條矮縮病發病率為4.86%，表現高抗；廣恢998的發病率為82.23%，表現高感，二者差異極顯著(圖1)。對白背飛虱的排驅性測驗結果顯示，抗蟲對照品種PTB33單株平均蟲量僅為1.2頭，明顯少于接種量5頭，表現出明顯的白背飛虱排驅性，而D4、廣恢998及TN1單株蟲量與接種量無顯著差異(圖2-A)，表明高抗南方水稻黑條矮縮病材料D4、高感材料廣恢998及高感對照材料TN1均無排驅性。抗生性測驗結果顯示，D4、廣恢998及TN1接種7 d后植株上白背飛虱存活率約90%，同時三者之間無顯著性差異，而高抗品種PTB33植株上白背飛虱存活率顯著下降，存活率僅為52.5%(圖2-B)，表明高抗南方水稻黑條矮縮病材料D4、高感材料廣恢998及高感對照材料TN1均無白背飛虱抗生性。綜合分析抗病性和抗蟲性表現，發現抗病材料D4無白背飛虱排驅性與抗生性，說明其對南方水稻黑條矮縮病的抗性為抗病毒性而非抗蟲性。

2.2 D4對南方水稻黑條矮縮病抗性的遺傳分析

從廣恢998與D4衍生的F2:3株系中隨機抽取267份F2:3株系進行人工接種鑒定，結果顯示該F2群體的南方水稻黑條矮縮病抗性呈偏正態連續性分布，表型分布部分偏向抗性親本D4(圖3)，表明D4的南方水稻黑條矮縮病抗性可能受主基因和微效基因共同控制。

A?D4接種南方水稻黑條矮縮病毒的表型；B?廣恢998接種南方水稻黑條矮縮病毒的表型。N?未接種對照；I?接種。

Fig. 1. Phenotype of D4 and Guanghui 998 by artificial inoculation of SRBSDV.

A?D4和廣恢998(GH998)及兩個對照品種對白背飛虱的排驅性表現；B?白背飛虱在D4和廣恢998及兩個對照品種中的存活率。數據用平均值±標準誤表示, n=3。柱上相同字母表示差異未達0.01顯著水平(t測驗)。

Fig. 2. Resistance to white-backed planthoppers(WBPH) in D4 and Guanghui 998.

圖3 廣恢998/D4 F2:3株系接種南方水稻黑條矮縮病后的發病率頻率分布

Fig. 3. Frequency distribution of the F2:3lines derived from the cross between Guanghui 998(GH998) and D4 with southern rice black-streaked dwarf disease as determined by artificial inoculation identification.

2.3 重測序數據統計

利用Illumina HiSeq測序系統對D4、廣恢998、抗池及感池進行全基因組重測序，共獲得110.39 G的測序數據，過濾后，獲得了106.05 G的有效數據。將親本及抗、感池的測序數據與參考基因組日本晴序列(http://rice.plantbiology.msu.edu/pub/data)比對(表1)，結果顯示D4獲得142 913 376條有效測序的reads，覆蓋基因組92.66%的序列，平均測序深度為55.88×。廣恢998獲得195 193 248條有效測序的reads，覆蓋基因組93.26%的序列，平均測序深度為76.28×；基于基因分型的結果，分別篩選D4和廣恢998中純合的SNP位點，共獲得2 977 061個多態性標記用于下一步的性狀相關QTL定位。

2.4 單核苷酸多態性(SNP)分析

以1 Mb為窗口、100 kb為步長計算每個子代池的SNP指數及其增值。對比感池與抗池的SNP指數，在95%置信水平下，大于閾值的窗口作為候選區間。在第9染色體上的16 300 001?17 700 001 bp區間出現了SNP不平衡的狀況(圖4)，表明感池單株在此區段與廣恢998含有相同的片段，而抗池單株在同一區域與D4含有相同的片段。以95%置信水平作為篩選閾值，該區域的SNP指數增值大于閾值，因此第9條染色體16 300 001?17 700 001 bp可能存在控制南方水稻黑條矮縮病的主效抗性QTL位點，命名為。

2.5 南方水稻黑條矮縮病主效抗性位點qSRBSDV9的驗證與精細定位

利用D4與廣恢998雜交、自交產生的F2群體及其衍生的F2：3株系對進行驗證及精細定位，對F2：3株系進行南方水稻黑條矮縮病人工接種鑒定，以F2：3的發病率來推測F2群體中各單株的表型和基因型。為了驗證定位結果的準確性，在第9染色體上設計了70對InDel引物，選取其中10對在親本間具有良好多態性的InDel標記(表2)，結合表型檢測F2群體基因型，結果顯示在標記Indel 7和Indel 40之間(物理位置為16.3 Mb?17.7 Mb)檢測到一個與南方水稻黑條矮縮病相關的主效抗性QTL，其位置與的位置相同。LOD值為4.8，可以解釋34.6%的表型貢獻率(圖5-A)。

表1 D4、廣恢998(GH998)、抗池(R-pool)及感池(S-pool)測序結果數據統計

Clean數據?原始數據量, 測序序列的個數乘以測序序列的長度, 以bp為單位；HQ clean數據?過濾之后的有效數據量, 過濾后測序序列的個數乘以測序序列的長度, 以bp為單位；平均測序深度?比對到參考基因組的堿基總數除以基因組大小；Read總數?有效測序數據的reads總條數；比對read數?比對到參考基因組上的reads條數(包括單端比對和雙端比對)；覆蓋度?測序獲得的序列占參考基因組(排除N區)的比例；GC含量?堿基G和C的數量總和占總的堿基數量的百分比；Q30含量?Phred數值大于30的堿基占總體堿基的百分比。

Clean data, Raw data production, the number of sequencing sequences multiplied by the length of the sequencing sequence; HQ clean, Valid data after filtering, the number of filtered sequencing sequences multiplied by the length of the sequencing sequence; Average depth, The total number of bases aligned to the reference genome divided by the genome size; Total reads, The total number of reads of validated data; Mapped reads, The total number of reads compare on the reference; Coverage, The proportion of the sequence obtained by sequencing to the reference genome; GC content, Percentage of the total number of bases G and C as a percentage of the total number of bases; Q30 content, Percentage of bases with Phred value greater than 30 to total bases.

橫坐標表示染色體位置, 縱坐標表示SNP指數增量(突變型減去野生型)。圖中每個點代表每個SNP指數增量, 相鄰的染色體分別用橙色和綠色的點來表示, 黑線代表各個窗口SNP指數的平均值擬合線。藍線代表95%置信水平的閾值線。

Fig. 4.(SNP-index) value distribution in rice chromosomes.

進一步在定位區間內開發了15對具有良好多態性的InDel標記，并對F2群體各株系進行基因型分析，最終篩選到12株在該區段重組的單株。結合F2:3株系的表型，最終將定位在InDel標記M10和M12之間，物理距離為第9染色體上17 393 019?17 495 354 bp(102.3 kb)區間內(圖5-B)。利用水稻基因組注釋數據庫MSU-RGAP(http://rice.plantbiology.msu.edu/)對候選基因組區域進行基因預測，發現該區段共包含21個基因，其中、、、、、、、及等9個基因編碼產物均為赤霉素受體蛋白。

3 討論

南方水稻黑條矮縮病是由白背飛風傳播的病毒病，寄主對其抗性分為抗蟲性和抗病性。目前，雖然一些學者鑒定出了一些抗南方水稻黑條矮縮病的材料[14, 27, 28]，但是關于不同水稻材料對南方水稻黑條矮縮病抗性特征的研究較少。本研究結果表明普通野生稻高代回交導入系D4對南方水稻黑條矮縮病的抗性主要來自于對病毒本身的抗性而非抗蟲性，這與D4在室內和田間抗性鑒定中的穩定高抗表現一致。南方水稻黑條矮縮病抗性的遺傳分析結果表明，其表現為數量性狀特征，這與水稻黑條矮縮病的抗性遺傳特征類似[35, 36]。

表2 本研究中定位qSRBSDV9所用的InDel標記

用常規方法培育抗南方水稻黑條矮縮病水稻品種耗時耗力，對水稻重要農藝性狀相關基因進行精細定位，開發與目標基因緊密連鎖的標記，可實現基因的直接選擇和有效聚合，大幅度提高育種效率，縮短育種年限[37]。然而，目前尚未見與南方水稻黑條矮縮病抗性相關的基因或QTL定位的研究報道。潘存紅等[38]利用珍汕97B/明恢63的RIL群體，在第9染色體上SSR標記RM257?RM215間檢測到一個黑條矮縮病抗性QTL，與不在同一位點。Chen等[39]在第9染色體上標記RG451?RM245間也檢測到抗白背飛虱位點。其中，與在第9染色體上的物理位置重疊，但本研究材料D4對白背飛虱無抗性，說明與不是同一個基因。本研究將來自抗源D4的南方水稻黑條矮縮病主效抗性QTL精細定位在第9染色體17 393 019 ?17 495 354 bp區域內，是一個新的與南方水稻黑條矮縮病抗性相關QTL。

在候選基因組區域內有21個預測基因，其中9個基因均編碼赤霉素受體蛋白。赤霉素(gibberellin，GA)是調控植物生長發育的一類重要激素，其主要作用為促進植物莖、葉伸長。Russell等[40]研究表明，大麥黃矮病毒(，BYDV)侵染大麥植株后，其體內的GA含量降低導致大麥矮化；Sridhar等[41]研究表明，受水稻東格魯球狀病毒(，RTSV)侵染后，寄主體內的GA同系物含量降低明顯，這可能是誘導植株矮化的一個主要原因；Zhu等[42]研究表明水稻矮縮病毒(，RDV)通過降低GA的合成而產生矮縮癥狀；吳建國等[43]研究也表明，水稻植株受RDV侵染后，染病株體內GA含量顯著低于健康株。楊陽[44]研究表明，感染南方水稻黑條矮縮病毒后，水稻植株體內的赤霉素含量顯著降低，這可能與南方水稻黑條矮縮病毒對水稻造成生長遲緩、植株矮化等癥狀有關。Tao等[45]研究發現，水稻黑條矮縮病(，RBSDV)編碼的P7-2蛋白與水稻植株的赤霉素代謝蛋白GID2相互作用，RBSDV對GA信號傳導途徑可能產生影響。在前期研究中，我們發現無論是抗病還是感病材料，感染南方水稻黑條矮縮病毒后，病株體內的赤霉素含量均顯著低于健康植株，但抗病植株體內的赤霉素含量比感病植株的含量高[46]。本研究中，在候選基因組區域內有21個預測基因，其中9個基因編碼赤霉素受體蛋白。這表明SRBSDV的侵染可能對水稻植株赤霉素信號轉導造成影響，進一步減少了赤霉素合成量，最終導致植株矮化。

A—連鎖分析；B—利用代換作圖精細定位qSRBSDV9。代換圖中黑色條狀區域代表來源于廣恢998的導入片段; 空白條狀區域代表來源于D4的導入片段；灰色條狀區域代表雜合雙親基因的片段。

Fig. 5. Identification and validation ofin rice chromosome 9.

本研究揭示了南方水稻黑條矮縮病的抗性特征及遺傳規律，精細定位了南方水稻黑條矮縮病主效抗性QTL，并對定位區間內的候選基因進行了分析和預測。

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Genetic Analysis and Fine Mapping of a Major QTL for the Resistance to Southern Rice Black-Streaked Dwarf Disease

NONG Baoxuan1, 2, 3, QIN Bixia4, XIA Xiuzhong2, 3, YANG Xinghai2, 3, ZHANG Zongqiong2, 3, ZENG Yu2, 3, DENG Guofu2, 3, CAI Jianhe4, LI Zhanbiao4, LIU Piqing1, *, LI Danting2, 3, *

(Agricultural College,,,;Rice Research Institute, Guangxi Academy of Agricultural Sciences,,;Guangxi Key Laboratory of Rice Genetics and Breeding,,;Plant Protection Research Institute,,,;Corresponding author,:;)

【Objective】(SRBSDV), which is transmitted by white-backed planthopper (Horváth, WBPH), has caused severe yield loss in epidemic years in rice production. We analyzed the resistance mechanism of SRBSDV and identified the related gene locus by fine gene mapping to lay a scientific base for effective prevention and control of SRBSDV. 【Method】The resistance of rice material D4 against white-backed planthoppers were analyzed, and the genetic basis for the resistance to SRBSDV was analyzed by using F2population of Guanghui 998×D4. The major QTL for resistance to SRBSDV was identified using QTL-seq, and further verified by genetic linkage analysis. 【Result】D4 was resistant to SRBSDV but not to WBPH. Genetic analysis showed that the resistance of D4 was controlled by major gene and minor genes. QTL-seq and linkage analysis revealed that the major QTL for resistance to SRBSDV in rice was located within the 1.40 M region on chromosome 9, which was termed as. Thenwas fine mapped on chromosome 9 with a 102.3 kb physical distance by substitution mapping. This region contained 21 predicted genes, nine of which were related to gibberellin signaling. 【Conclusion】The results reveals the characteristics and inheritance of resistance to SRBSDV in D4. The fine mapping oflays a base for map-based cloning and utilization

; white-backed planthopper; genetic analysis; QTL; fine mapping

10.16819/j.1001-7216.2019.8057

S435.111.4+9; S511.034

A

1001-7216(2019)02-0135-09

2018-05-16;

2018-12-20。

國家重點研發計劃資助項目(2016YFD0100100)；廣西科技計劃資助項目(桂科AB16380117)；水稻生物學國家重點實驗室開放課題(160105; 170102)；廣西農業科學院基本科研業務專項(2015YT15, 桂農科2018YM16)。