不同超聲處理時間對雞血血漿蛋白物化性質和結構的影響

楊 恒，盛 偉，張新笑，李鵬鵬，王道營，鄒 燁，徐為民

（1.南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院，江蘇南京 210023；2.江蘇省農業(yè)科學院農產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京 210014）

動物血漿年產(chǎn)量大，營養(yǎng)豐富，血漿中含有纖維蛋白、白蛋白、球蛋白以及其他少量脂蛋白、糖蛋白等［1-3］，而血漿中的蛋白質總稱為血漿蛋白［4］。血漿蛋白中含有人體所需的18種氨基酸，其中包括8種必需氨基酸，其中賴氨酸（Lys）可達6.50%以上［5］，血漿蛋白中含有豐富的礦物質，磷含量約占血漿蛋白粉總量的1.78%，鈣含量達到0.20%，鐵含量達到78 mg/kg［6］，另外，血漿蛋白中還含有較多的促生長因子、干擾素、激素、溶菌酶等其他功能成分［7］。

我國每年的肉雞屠宰量達10億多羽，雞血來源豐富。雞血中含大量蛋白質、氨基酸、微量元素、維生素、酶類和其他生物活性物質，而脂肪和糖類含量較低，其中含干物質17.90%、礦物質5.90%（大部分為鐵）、必要元素2.30%、磷0.56%［8-9］，而雞血細胞中必需氨基酸含量在畜禽動物中最高，但目前對雞血的研究較少，而且大量的雞血作為廢棄物排放，造成資源浪費和環(huán)境污染。

本研究旨在通過測定不同超聲處理時間下雞血漿蛋白的多種理化特性，全面分析超聲作用對血漿蛋白性質和結構的影響，為血漿蛋白的應用提供理論基礎，使其在醫(yī)藥工業(yè)、食品工業(yè)和飼料工業(yè)等方面有更廣闊的前景。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 材料 雞血漿蛋白凍干品：實驗室自制。主要操作：取少量檸檬酸三鈉飽和溶液加入現(xiàn)取雞血血漿并攪拌均勻，后采用60 mL離心管分裝，以3 000～3 500 r/min離心15 min，取上清液裝入表面皿，用保鮮膜、橡皮筋封存，放入-40℃冰箱保藏。待樣品完全凍結后放入凍干機42～45 h后取出即得到試驗用血漿蛋白粉。

1.1.2 主要試劑 1-苯氨基-8萘橫酸鹽（ANS）、β-巰基乙醇（購自美國Sigma公司）；Marker（購自上海源葉生物科技有限公司）；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉（購自西隴化工股份有限公司）；考馬斯亮藍（購自南京建成生物科技有限公司）；Tris、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉（購自南京榮勝達實驗儀器有限公司）；鹽酸（購自揚州滬寶化學試劑有限公司）。

1.1.3 主要儀器 FL-4600熒光分光光度計，購自日本日立高新技術公司；UV-6100紫外/可見光分光光度計，購自上海元析儀器有限公司；T-25型數(shù)顯勻漿機，購自德國IKA公司；M124A電子天平，購自意大利Bel公司；便攜式pH計，購自美國奧豪斯公司；HJ-8（DF-1）集熱式磁力攪拌器，購自常州國華電器有限公司；Jasco-715圓二色譜儀，購自日本Jasco公司；真空冷凍干燥機，購自德國Christ公司；Uni Cen MR冷凍離心機，購自德國Herolab公司；超聲波細胞破碎儀，購自寧波新芝生物科技股份有限公司；多功能微孔板檢測儀，購自美國Bio Tek公司；激光粒度分析儀（Nano-ZS 90），購自英國Malvern公司；超純水機（Milli-Q），購自美國Millipore公司；Q20差式量熱掃描儀，購自美國TA公司；JS-680C全自動凝膠成像分析儀，購自上海培清科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同超聲時間試驗用血漿蛋白粉制取 將未經(jīng)超聲處理的血漿蛋白粉20 g溶于400 mL雙蒸水中獲得5%溶液，分別將溶液經(jīng)超聲波細胞破碎儀用固定頻率150 W 超聲處理0、5、10、20、30 min，得到5種不同處理的樣品。對不同超聲時間的溶液表面皿封存，凍干得到蛋白粉備用。

1.2.2 血漿蛋白物化性質的測定

1.2.2.1 SDS-PAGE凝膠電泳測蛋白分子量及蛋白質種類

上樣前處理：取20μL蛋白樣品，加入5μL上樣緩沖液（pH值8.8的0.06 mol/L Tris-HCl緩沖液、2.0% SDS、5.0% β-巰基乙醇、25.0%甘油、0.1%溴酚藍）混合，于95℃條件下反應5 min，12 000 r/min離心5 min，取15～20μL處理后樣品上樣，同時制備12%分離膠和5%濃縮膠。采用分子量蛋白Marker（11～135 ku）作為對照。電泳緩沖液為0.025 mol/L Tris-HCl、0.192 mol/L甘氨酸、0.1% SDS，電泳先在電壓80 V進行20～30 min，后在120 V電泳至條帶與膠底面平行。電泳結束后，采用考馬斯亮藍R-250染色20～30 min，然后用脫色液（甲醇∶乙酸∶水＝1∶1∶8）脫色，直至可清楚地辨別條帶。

1.2.2.2 圓二色譜測蛋白質二級結構 采用圓二色譜儀測定樣品溶液的近紫外圓二光譜變化。將制備的樣品配制成濃度為0.5 mg/mL蛋白溶液，注入1 mm厚的樣品池。設定圓二色譜儀參數(shù)為：掃描范圍190～250 nm，掃描速度50 nm/min，光譜間隔1.0 nm。得到CD數(shù)據(jù)以平均橢圓率表示，采用CDPro軟件進行二級結構分析。

1.2.2.3 熒光光譜 采用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH值7.0）將樣品溶液配制成蛋白濃度為0.2mg/mL。熒光光譜采用激發(fā)波長為290 nm掃描，測定的發(fā)射波長范圍為300～460 nm，狹縫寬度均為2.5 nm。每個樣品測定重復3次。

1.2.2.4 表面疏水性的測定 將樣品配制成10 mg/mL的蛋白溶液，后采用0.01mol/L PBS緩沖溶液（pH值7.0）將樣品液稀釋1、2、4倍。取4.0 mL稀釋后的蛋白溶液與20μL 80 mmol/L ANS磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH值為7.0）混勻，室溫下放置2 min后測定熒光強度。設置參數(shù)為：激發(fā)波長371 nm，發(fā)射波長467 nm，掃描速率240 nm/min，狹縫寬度10 nm。得到數(shù)據(jù)以蛋白質質量濃度（mg/mL）對熒光強度作圖，采用線性回歸分析進行曲線擬合，直線斜率即是蛋白質的表面疏水性（H0）指數(shù)。

1.2.2.5 自由巰基含量測定 準確量取0.5 mL質量濃度為10 mg/mL的蛋白液樣品，后加入2.50 mL Tris-Gly-8M Urea溶液和0.02 mL 4 mg/mL的DTNB溶液，迅速混合后于25℃反應25 min，波長412 nm下測定吸光度（D412nm），并以蒸餾水作空白對照。每個樣品做3次平行試驗，最終結果取其平均值，并按公式（1）進行計算：

式中：73.53＝106/（1.36×104），1.36×104為Ellman試劑的摩爾消光系數(shù)；D412nm為波長412 nm下所測得的吸光值；C為蛋白質樣品的質量濃度，單位為mg/mL；D為稀釋因子，在游離巰基測定中D值取為6.04。

1.2.2.6 差式掃描量熱 取樣品3～6 mg用差示量熱掃描儀（DSC）進行掃描，掃描溫度為室溫至20℃，掃描速度為5℃/min（程序升溫），所有的測定都要在氮氣環(huán)境下進行。最大變性溫度（Tmax）用Ver 1.2 N Software（TA Instruments）分析。

1.2.2.7 粒徑分布 超聲處理和未超聲的血漿蛋白粒度分布采用Nano-ZS90激光粒度儀進行測定，介質為蒸餾水，折射率為1.361，測定時以蒸餾水為背景。設置物質折射率為1.52，加入樣品至遮光率達10%～20%后，進行信息采集。每個樣品平行采集3次，取平均圖譜。

1.2.2.8 Zeta電位分析 Zeta-電位（ζ，mV）也用Nano-ZS90激光粒度儀來測定。采用超純水將蛋白質溶液稀釋成0.5%（質量分數(shù)），加入樣品電位測量池測量。ζ是通過電導遷移率（UE）采用激光多普勒測速技術結合相分析光散射來計算。

1.2.2.9 掃描電鏡 將超聲處理和未超聲的蛋白冷凍干燥后進行掃描電子顯微鏡觀測。操作流程：將樣品置于樣品臺，經(jīng)離子濺射儀真空干燥、金粉噴鍍后，調節(jié)電鏡加速電壓為20 kV，對樣品進行觀測攝圖。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

上述所有試驗均3次重復，結果表示為“平均值±標準差”。采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行處理，Origin 9.0作圖，采用組間ANOVA進行統(tǒng)計分析，Turkey檢驗用于組間數(shù)據(jù)分析，P＜0.05表示兩組間差異顯著。

2 結果與分析

2.1 血漿蛋白凝膠電泳分析

將不同超聲處理時間的雞血血漿蛋白樣品上樣進行SDS-PAGE分析，檢測并比較不同超聲處理時間雞對血漿蛋白亞基組成的影響。由圖1可知，不同超聲時間的雞血漿蛋白條帶其清晰度和數(shù)目均無明顯差異［10］，各雞血漿蛋白的亞基分子量主要集中在43～95 ku，蛋白條帶完整，無雜碎條帶，該結果表明不同超聲時間處理并未改變雞血血漿蛋白的亞基組成［11］。

2.2 圓二光譜

圓二色性主要由肽鍵的電子躍遷引起，因此圓二色譜可反映蛋白質主鏈肽鍵的構象，其遠紫外（190～250 nm）能夠提供蛋白質二級結構（α-螺旋，β-折疊，β-轉角和無規(guī)卷曲）含量信息［12-13］，是檢測蛋白質結構變化的重要指標，可根據(jù)遠紫外圓二光譜來分析蛋白質的二級結構。由圖2可知，雞血漿蛋白在超聲功率150W 下處理0、5、10、20、30 min，雞血漿蛋白在209 nm和222 nm處有2個負峰，在193 nm處有1個正峰，這是典型的α-螺旋結構特征峰［14］。不同超聲時間處理的蛋白其圖譜幾乎無改變，且α-螺旋含量大致相同，此結果與表1數(shù)據(jù)相符，說明本試驗中不同的超聲處理時間并沒有破壞血漿蛋白的二級結構，這與王金梅等的結論［15］一致。β-折疊含量高則α-螺旋和β-轉角含量低，β-折疊含量低則α-螺旋和β-轉角含量高，而無規(guī)則卷曲幾乎不變，這說明α-螺旋、β-轉角和β-折疊之間存在著一種相互轉化關系，維持一種動態(tài)平衡。

2.3 熒光光譜

熒光光譜通過測定樣品蛋白質中部分能產(chǎn)生熒光的氨基酸殘基（色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）可推測其蛋白構象的變化趨勢，這是表征蛋白質分子構象發(fā)生變化的一種常用手段［16］，通過熒光強度和峰位變化可反映蛋白質局部三級結構的變化［17］。由圖3可知，雞血漿蛋白的最大發(fā)射熒光強度在335 nm處改變，但不同處理時間雞血漿蛋白的最大發(fā)射熒光強度波長位置基本不變，但是超聲處理5、10、20 min的血漿蛋白熒光強度高于超聲0 min血漿蛋白，這可能是由于雞血漿蛋白經(jīng)超聲處理后，超聲波產(chǎn)生的機械效應和空化效應使蛋白內部肽鏈伸展程度變大，暴露出部分掩埋于分子內部的疏水基團，從而熒光強度發(fā)生了增強［18］。賈俊強等通過超聲處理麥胚清蛋白后其熒光強度發(fā)生明顯增強［19］，本結果與之一致。而超聲30 min雞血漿蛋白熒光強度明顯下降且最大發(fā)射峰強峰位較對照組有較小程度的紅移，這可能是由于蛋白質分子間作用力而發(fā)生了熒光猝滅作用［20］。該結果還說明不同超聲處理時間可改變雞血漿蛋白分子的高級構象［21］。

表1 蛋白質二級結構含量信息

2.4 雞血漿蛋白表面疏水性測定

表面疏水性是蛋白質重要的表面性質，研究表明表面疏水性是影響蛋白質功能特性的重要因素，對保持蛋白質穩(wěn)定構象和生物活性具有重要作用［22］。熒光探針法是測定蛋白質疏水性最廣泛的方法，其優(yōu)點是蛋白用量少，操作簡單便捷［23］。ANS探針熒光在水溶液中單獨存在時，熒光量子產(chǎn)量較低，隨著ANS與蛋白質結合，熒光強度顯著增強，通過這一特性可以表征雞血漿蛋白的表面疏水性［24］。由圖4可知，經(jīng)過不同超聲時間處理的雞血漿蛋白表面疏水性顯著提高，這可能是由于超聲波的空穴效應，導致雞血漿蛋白質相互碰撞后發(fā)生卷曲、折疊，蛋白結構被破壞，在水溶液中暴露出疏水性氨基酸殘基，更多的血漿蛋白與ANS相結合，熒光強度增強，其表面疏水性顯著提高［25］。賈俊強等發(fā)現(xiàn)通過超聲頻率為1 800W 的超聲波處理后小麥胚芽球蛋白溶液的表面疏水性提高了［26］。超聲10 min雞血漿蛋白與超聲5 min雞血漿蛋白相比表面疏水性下降了，但是其差值不及超聲20 min與超聲10 min的差值。表面疏水性下降可能是因為隨著超聲處理時間的提高，蛋白質間相互作用加強，蛋白質的表面疏水性增加，當表面疏水相互作用達到一定程度時蛋白質的亞基聚集形成共價鍵及氫鍵等結構，使得一部分疏水基團被包埋，疏水相互作用減弱，疏水性降低［27-28］。超聲處理20 min和30 min的血漿蛋白疏水性顯著低于超聲處理10 min的蛋白樣品，這可能是超聲處理使雞血漿蛋白間的相互作用達到穩(wěn)定狀態(tài)，疏水性保持穩(wěn)定。

2.5 自由巰基

巰基基團含量變化可反映蛋白質變性程度，對探究蛋白的功能性質利用有重要作用［29］。由圖5可知，在超聲5 min、超聲10 min、超聲20 min組別中，經(jīng)過超聲處理的血漿蛋白其自由巰基含量提高，這可能是由于超聲處理破壞了蛋白分子間的二硫鍵和巰基互相轉化［30］，使埋藏在蛋白分子內的巰基暴露出來，蛋白分子空間結構得到伸展［31］。Hu等發(fā)現(xiàn)，超聲處理增加了大豆分離蛋白的游離疏基含量［32］，本試驗結果與之一致。在超聲處理30 min組自由巰基含量出現(xiàn)明顯下降，這可能是由于長時間超聲處理使得蛋白質中部分—SH被重新氧化成S—S［33］，使巰基基團被重新包埋。蛋白質自由巰基含量還受到其他因素影響，試驗操作中溫度的改變或樣品溶液的復雜性都會改變自由巰基含量［27，34］。同時，不同超聲處理時間下雞血漿蛋白樣品的巰基變化趨勢與疏水性相似，這可能是由于超聲時間增加，蛋白質變性程度增加，同時蛋白質分子間相互作用形成更多的蛋白質聚集體。

2.6 差式掃描量熱

由表2可知，雞血漿蛋白熱掃描出現(xiàn)2組溫度數(shù)據(jù)，這是血漿蛋白中2種主要蛋白（白蛋白和球蛋白）的變性溫度及熱焓變，與Dergez等研究［35］一致。經(jīng)過超聲處理的血漿蛋白變性溫度較對照組均有所下降，且大致呈逐步下降趨勢，雞血漿蛋白對熱的敏感性增強。這可能是超聲處理影響了血漿蛋白的熱穩(wěn)定性，使血漿蛋白的三級結構發(fā)生了改變，空間立體性增加，蛋白與蛋白之間的交聯(lián)發(fā)生改變，這與史培磊等的試驗結果［36］相類似。

2.7 粒徑分布

不同超聲處理時間（0、5、10、20、30 min）對雞血漿蛋白粒徑的影響見圖6。由圖6可知，經(jīng)過超聲處理的血漿蛋白明顯平均粒徑均低于未超聲處理的樣品［37］。但還可以看到粒徑并沒有隨著超聲時間的增加而持續(xù)減小，超聲30 min雞血漿蛋白粒徑大于超聲20 min組，同時超聲5 min的血漿蛋白粒徑跨度即粒徑圖寬度顯著變大，而其他超聲時間下蛋白粒徑又存在減小現(xiàn)象，說明可能蛋白分子一部分發(fā)生了分解作用，一部分發(fā)生了聚集作用。這一結果與葉鈺等的研究結果［38］一致，而出現(xiàn)這一現(xiàn)象的本質原因可能是超聲過程中的空化作用產(chǎn)生極強的剪切力，破壞了蛋白質分子間的共價或非共價作用［39］，使粒徑分布較大的血漿蛋白分子分解成較小的蛋白質分子。

表2 血漿蛋白的差式量熱掃描數(shù)據(jù)

2.8 蛋白表面電荷

Zeta電位是表征膠體分散系穩(wěn)定性的重要指標，可近似用來表示表面電荷。Zeta電位的絕對值越大，說明膠體的體系越穩(wěn)定；反之，Zeta電位絕對值越小，蛋白質分子排斥力會小于吸引力，分子會有吸引聚集的趨勢［40］。由圖7可知，經(jīng)過固定頻率超聲處理的血漿蛋白其Zeta電位絕對值都大于未超聲處理組，這與Ryan等的研究結果［41］一致。Schmitt等認為Zeta電位絕對值大于20 mV，膠體較穩(wěn)定［42］，所以經(jīng)過超聲處理的血漿蛋白穩(wěn)定性增強。本研究中經(jīng)過超聲處理的血漿蛋白穩(wěn)定性增強明顯。

2.9 掃描電鏡

由圖8可知，隨著超聲時間的增加，蛋白質的結構出現(xiàn)孔隙，變得疏松甚至分離，表面結構發(fā)生改變，這符合超聲處理產(chǎn)生的剪切力破壞了分子間氫鍵和范德華力，使蛋白質發(fā)生分散，形成更加寬松的層狀結構［43］。這與馮景麗等采用超聲處理酪蛋白表面微觀結構變得片層化和“空洞”化［44］是一致的。

3 結論

試驗結果表明，超聲處理不會破壞雞血漿蛋白的亞基組成和二級結構，但會顯著影響蛋白的三級結構、表面性質、粒徑分布和表面微觀形態(tài)。在超聲頻率不變時，改變超聲時間對血漿蛋白的作用效果不是呈現(xiàn)相關性增長，而是一種不確定的改變，并不是超聲時間越長達到的效果越好，根據(jù)實際需要達到的效果可選擇最適超聲時間。而本研究證明超聲對改變蛋白質功能結構的有效性，為超聲處理蛋白質改善蛋白質的功能特性利于其應用于生活中提供了理論基礎。