抗黃萎病轉基因棉花對灰巴蝸牛（Bradybaena ravida）的影響

方志翔，張 莉，沈文靜，郭汝清，劉 標

（生態環境部南京環境科學研究所/國家環境保護生物安全重點實驗室，江蘇南京 210042）

軟體動物是動物界中種類繁多的一個分支，已知種類有13萬多種［1］。由于分布地域廣泛并且物種極其豐富，軟體動物在全球陸地和水生生態系統中都扮演了重要的角色。在指示生物和生物監測領域，軟體動物可以被成功地用來獲取陸地、海洋和淡水生態系統的環境質量信息［2］。就目前研究來看，軟體動物中的腹足綱最多地應用于環境監測這一領域。腹足綱代表著唯一一類分布在陸地生態系統的軟體動物。大部分陸棲腹足綱屬于肺亞螺綱，只有少數種類屬于前腮亞綱。蝸牛泛指腹足綱的陸生所有種類，生活于灌木叢、矮草叢、農田及住宅附近陰暗潮濕地區，世界各地均有分布。在過去的20年間，人們對利用以蝸牛為代表的腹足綱土壤動物進行生物監測展現出越來越濃厚的興趣，并且開展了一系列卓有成效的研究［3-7］。

近年來，轉基因植物在全球范圍內種植規模不斷擴大，但是關于其生態環境安全性的爭議一直存在，大量的物種被用來對轉基因植物的環境生態安全性進行評價［8］。蝸牛作為一種食譜廣泛的植食性生物，很容易在自然條件下直接或間接食用或接觸轉基因植物。目前不論野生狀態下的蝸牛還是人工飼養條件下的蝸牛，其食物來源大多都是植物。另外，蝸牛一部分生活時間在植物根部土壤中，會接觸土壤。而目前有文獻報道，轉基因作物的外源蛋白會隨著根系分泌物或者殘體降解而殘留于土壤中，并持續較長時間［9-11］。所以，評價轉基因植物對蝸牛的影響，對于研究轉基因植物對非靶標生物影響以及對自然生態環境影響是十分必要的。國外有學者研究過轉Bt基因作物對蝸牛的影響，也有使用純化Bt蛋白對蝸牛進行毒理試驗，但試驗結論也是各執一詞褒貶不一［12-16］。

本研究以在我國農田廣泛存在的灰巴蝸牛（Bradybaena ravida）為研究對象，分別采取了棉葉直接喂飼法和人工飼料添加棉葉法在室內進行了灰巴蝸牛的飼養，研究了抗黃萎病轉基因棉花對其的影響。后一種方法避免了現有普通飼養方法易受季節影響，在秋冬季缺少植物鮮活組織從而影響試驗，尤其是長期試驗進行的弊端，為室內長期蝸牛飼養試驗打下了基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用蝸牛于2017年6月采集自南京市六合區菜地中，共50只，經鑒定為灰巴蝸牛。

抗黃萎病轉基因棉花JA1由江蘇省農業科學院提供，抗黃萎病基因Gbvdr2來源于海島棉品種海7124，親本棉花（CK）為陸地棉品種泗棉3號。

1.2 試驗設計

1.2.1 飼養條件 本研究于2017年6—10月在環境保護生物安全重點實驗室內進行。將野外采集的蝸牛置于飼養盒中，底部鋪5～10 cm的人造土壤，其成分包括40%黃沙、20%泥炭土、40%高嶺土，混合均勻后采取濕熱滅菌法滅菌，冷卻后調節pH值為5～7，濕度40%左右，以紗布罩住盒口，置于人工氣候箱中，保持溫度在25～30℃，空氣相對濕度保持85%左右，光/暗周期12 h/12 h。投放無農殘的有機青菜葉、空心菜葉預喂飼蝸牛備用。

1.2.2 飼養飼料 喂飼試驗分為棉葉直接喂飼和人工飼料添加棉葉粉末喂飼2種。

1.2.2.1 棉葉 采集自抗黃萎病轉基因棉花JA1及其親本泗棉3號，定期采集鮮嫩足量棉葉喂飼蝸牛。

1.2.2.2 人工飼料 人工飼料配方：每份人工飼料包括玉米粉100 g、大豆粉100 g、小麥粉100 g、酵母粉50 g、磷酸氫鈣30 g、蔗糖20 g、復合維生素（煙酰胺1.0 g、硫胺素0.25 g、核黃素0.50 g、吡哆素0.25 g、鈷胺素0.02 g、葉酸0.25 g、泛酸鈣1.0 g、生物素0.02 g），體積分數40%的甲醛1 mL，加水600 mL。攪拌混勻后濕熱滅菌，冷卻凝固后切成片狀置于小的培養皿中，將培養皿置入土里，略微露出邊沿。

按照試驗需要，在上述人工飼料中添加不同劑量的經超低溫冷凍研磨粉碎后的轉基因植物組織粉末，對照組添加親本植物組織粉末，喂飼蝸牛。

1.3 試驗方法

1.3.1 蝸牛短期喂飼棉葉死亡率試驗 以抗黃萎病轉基因棉花JA1及其親本棉花幼嫩莖葉喂飼蝸牛，陽性對照組喂飼涂抹四聚乙醛的菜葉（1 g/g菜葉），每組設3只貝殼螺旋數接近、大小質量近似的蝸牛，持續喂飼72 h，分別在24、48、72 h監測蝸牛的死亡率。

1.3.2 蝸牛取食率試驗 測定蝸牛取食棉葉的效率，挑選貝殼螺旋數接近、大小質量近似的單只蝸牛放入培養瓶，將不同的棉花葉片打成直徑3 cm的圓片，每個培養瓶中放置1種棉花葉片1張，2組處理各設3次重復，記錄24 h內的取食率。

1.3.3 蝸牛短期喂飼人工飼料試驗 以抗黃萎病轉基因棉花JA1及其親本棉花莖葉經超低溫冷凍研磨后加入飼料喂飼蝸牛，1 kg飼料中混入棉花莖葉組織細粉100 g和200 g，陽性對照組喂飼加入四聚乙醛的飼料。每組設3只螺旋數一致、大小質量接近的蝸牛，持續喂飼72 h，分別在24、48、72 h監測蝸牛的死亡率。

1.3.4 蝸牛長期喂飼人工飼料試驗 以抗黃萎病轉基因棉花JA1及其親本棉花喂飼蝸牛，1 kg飼料中混入棉花莖葉組織細粉200 g，每組設3只質量接近的幼貝（3螺層），分別稱量其體質量并記錄，持續喂飼70 d，期間每14 d監測1次體質量。

1.3.5 蝸牛人工飼料取食率試驗 以抗黃萎病轉基因棉花JA1及其親本棉花喂飼蝸牛，1 kg飼料中混入棉花莖葉組織細粉200 g，每組設3只螺層、質量接近的成貝（5螺層以上）作為重復，每次喂飼前后對飼料進行稱量，計算24 h內蝸牛的取食量。

1.3.6 蝸牛SOD酶活4號測定 在棉葉短期喂飼試驗結束后，取蝸牛去殼勻漿，使用SOD酶檢測試劑盒（南京建成生物公司）檢測其體內SOD酶活性。

1.4 數據處理

使用MS Excel 2010軟件進行數據的處理和作圖，用SPSS 13.0軟件進行統計分析，采用單因素方差分析Oneway ANOVA和最小顯著差異法（LSD，α＝0.05）比較不同處理間差異的顯著性。

2 結果與分析

2.1 蝸牛短期喂飼葉片死亡率

喂飼不同棉花葉片后的72 h內，不同處理組的死亡率情況見表1。從表1可以看出，在試驗開始的24、48、72 h內，喂飼棉花轉基因棉花和親本棉花葉片的蝸牛均未出現死亡情況，而喂飼涂抹四聚乙醛棉葉的蝸牛則全部死亡。

2.2 蝸牛葉片取食率

喂飼不同棉花葉片24 h后，不同處理組的取食率見表2。從表2可以看出，喂飼親本棉花葉片的蝸牛取食率達53.18%，而喂飼轉基因棉花JA1葉片的蝸牛取食率為52.13%，二者對棉花葉片的取食率沒有顯著性差異。

表1 蝸牛喂飼葉片急性死亡率

表2 蝸牛葉片取食率

2.3 蝸牛短期喂飼人工飼料死亡率

以人工飼料添加棉花莖葉組織粉末喂飼蝸牛，不同時段蝸牛死亡率見表3。添加棉花莖葉組的蝸牛不論轉基因組還是親本組，高劑量組還是低劑量組，在72 h內均未出現死亡情況，喂飼添加四聚乙醛人工飼料組的蝸牛則全部死亡。

表3 蝸牛喂飼人工飼料急性死亡率

2.4 蝸牛長期喂飼人工飼料試驗

蝸牛長期喂飼人工飼料體質量變化情況見圖1。在喂飼轉基因棉花及其親本棉花葉片飼料的0、14、28、42、56、70 d分別測定蝸牛的體質量，在轉基因棉花和親本棉花處理組之間，其體質量增長趨勢一致，同一時間內，不同處理組間差異不顯著。

2.5 蝸牛喂飼人工飼料取食量測定

使用添加轉基因棉花及其親本棉花粉末的人工飼料喂飼蝸牛，24 h內的蝸牛取食量結果見圖2，在不同處理組之間，取食量并沒有顯著性差異。

2.6 蝸牛SOD酶活測定

在棉葉短期喂飼試驗（72 h）結束后，檢測了蝸牛SOD酶活性，結果見圖3。在喂飼轉基因棉花及其親本棉花葉片的蝸牛之間，其體內SOD酶活沒有顯著性差異。

3 結論與討論

蝸牛是農業上的一種害蟲，覓食范圍非常廣泛，可危害豆科、十字花科和茄科蔬菜，以及棉、麻、甘薯、禾谷類作物，桑樹、果樹等樹木；農地中的蝸牛食用農作物的葉、莖、芽、花和多汁的果實，可造成葉片穿透狀孔洞、斷苗、傷殘果等，并傳播作物病害，危害蔬菜、花卉、中藥材、果樹等多種農作物。另外，部分蝸牛品種因為營養豐富，味道鮮美，或者外型適合觀賞而被大量人工養殖帶來可觀的經濟效益。目前，我國棉田野生蝸牛品種以灰巴蝸牛與同型巴蝸牛為主。灰巴蝸牛，柄眼目，巴蝸牛科，廣泛分布在我國東北、華北、華東、華南、華中、西南、西北等地區。寄生于黃麻、紅麻、苧麻、棉花、豆類、玉米、大麥、小麥、蔬菜、瓜類等危害莖葉造成缺刻，嚴重時咬斷嫩苗，造成缺苗斷壟［17-20］。因此，以灰巴蝸牛為代表性研究對象，對于探索轉基因棉花對蝸牛的影響有著現實的意義。筆者在野外采集灰巴蝸牛，在實驗室對其進行了人工飼養，用于試驗。

試驗結果表明，直接喂飼轉基因棉花葉片的蝸牛與喂飼親本棉花葉片的蝸牛相比，在進行72 h喂飼后，沒有出現死亡現象，并且，二者對棉葉的取食率也沒有顯著性差異。表明轉基因棉花對蝸牛并沒有急性毒性效應。另外，為了保證長期飼養試驗的進行，筆者還研發了人工飼料添加棉花葉片粉末喂飼蝸牛的新方法，該方法保證了在非棉花生長期對蝸牛的長期飼養。人工飼料喂飼試驗結果表明，72 h內，喂飼轉基因棉花人工飼料的和親本棉花人工飼料的處理組均未出現蝸牛死亡現象。喂飼70 d的長期試驗結果表明，不同處理組之間蝸牛體質量增長趨勢一致，相同時期沒有顯著性差異。單貝取食人工飼料的質量，在不同處理組間也沒有顯著性差異。72 h喂飼試驗結束后，檢測了蝸牛體內的SOD酶活性，轉基因棉花組與親本棉花組之間沒有顯著性差異。

近年來，轉基因植物在世界上的種植規模不斷擴大，但爭議一直存在。我國政府保持著積極研發、慎重推廣的態度，這就要求我們的轉基因作物環境安全評價工作一定要全面、長期、深入開展。本研究以我國種植面積最大的轉基因植物棉花為評價目標，以數量龐大的軟體動物門代表性動物蝸牛為研究對象，進行了安全評價工作，為轉基因棉花的環境安全評價增添了新數據。