不同草田輪作方式對土壤肥力、微生物數量及自毒物質含量的影響

尹國麗，蔡卓山，陶茸，吳芳，陳建綱，師尚禮

(甘肅農業大學草業學院，草業生態系統教育部重點實驗室，中-美草地畜牧業可持續研究中心，甘肅 蘭州 730070)

紫花苜蓿(Medicagosativa)具有優良的飼用價值和固氮、保持水土、改良土壤結構等多重生態功能，在世界五大洲廣泛種植，素有“牧草之王”的美稱[1]，隨著農業可持續發展戰略和糧改飼工程的實施，紫花苜蓿的重要性日益凸顯。但是，作為多年生牧草，紫花苜蓿連作一定年限后會產生連作障礙，成為限制紫花苜蓿種植的一個瓶頸問題。研究證實，連作障礙的發生不僅與土壤理化性質的改變有關，還與土壤微生物的組成有關[2]，土壤微生物作為土壤中的活性因子，是反應土壤質量最敏感的指標之一，近年來已有大量的研究表明土壤微生物與連作障礙之間存在密切關系[3-5]。除此而外，作物的自毒作用也是引起連作障礙一個不容忽視的方面[6]。紫花苜蓿種子中含有水溶性自毒物質[7]，植株分泌自毒物質，經過多年連續種植后的累積，會產生自毒現象，導致土壤養分過度積累或消耗、自毒物質積累、苜蓿產量品質下降等。

草田輪作是農業生產中消減連作障礙普遍采用的措施之一，試驗證明輪作不僅可以調節不同作物之間對養分吸收的差異，避免養分失衡，提高土壤養分的有效性和酶活性，還可以通過根系分泌物的變化，調節根際微生物群落的組成，減少土傳病蟲害的發生，同時利用不同作物對自毒物質的反應不同，可減輕自毒危害，提高經濟效益[8]。王勁松等[9]研究發現，對高粱(Sorghumbicolor)連作3年地輪作苜蓿和蔥(Alliumfistulosum)，可以提高土壤微生物活性和酶活性，控制高粱的連作障礙，增加高粱產量。秦舒浩等[10]研究得出合理輪作天藍苜蓿(Medicagolupulina)、隴東苜蓿(Medicagosativa)和箭筈豌豆(Viciasativa)3種豆科植物，對馬鈴薯(Solanumtuberosum)連作農田土壤速效氮、速效磷及速效鉀含量均有不同程度的促進作用。

科學合理的輪作模式可以有效緩解連作障礙引起的土壤環境惡化，使土壤中微生物活性增強、多樣性增加，為后續作物生長提供健康穩定的土壤生態環境[11]。目前關于紫花苜蓿草田輪作的研究報道相對較多，但前人的研究多集中在輪作對農田土壤肥力及產量的影響方面，缺乏紫花苜蓿-作物輪作系統中土壤自毒物質含量方面的研究報道[12]。鑒于此，本試驗以5齡紫花苜蓿草地為研究材料，分析在不同輪作模式下土壤自毒物質含量、土壤肥力及土壤微生物的動態變化及其相互關系，旨在探索紫花苜蓿連作障礙的形成機制，為采用輪作措施消減紫花苜蓿連作土壤自毒效應提供科學依據，并為半干旱地區草田輪作和草地生態農業的可持續發展提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗在甘肅省武威市涼州區甘肅農業大學黃羊鎮牧草實驗站開展。該地區位于甘肅河西走廊東端(E 103°5′，N 37°30′)，屬冷溫帶干旱區，是典型的大陸性氣候，日照充足，春季多風沙，夏季有干熱風。平均海拔1776 m，降水年際變化不大，但季節變化較大，多年平均降水量160 mm，主要集中在7、8、9三個月，冬春季干旱，降水無法滿足作物生長的需要。年蒸發量2400 mm，年平均氣溫7.2 ℃，1月最低氣溫 -27.7 ℃，7月最高氣溫34.0 ℃，≥0 ℃年積溫3513.4 ℃，≥10 ℃年積溫2985.4 ℃。全年無霜期156 d，絕對無霜期118 d，年日照時數2945 h。土壤以荒漠灌淤土為主，粉沙壤質，土層深厚。

1.2 供試材料

供試材料小麥(Triticumaestivum)品種為雜交種春寧4號，玉米(Zeamays)品種為雜交種隴單4號，紫花苜蓿品種為甘農3號。小麥及玉米種子市售，紫花苜蓿種子由甘肅農業大學草業學院提供。

1.3 試驗設計

試驗地位于甘肅省武威市黃羊鎮甘肅農業大學牧草實驗站。選取地勢平坦的紫花苜蓿草地進行草田輪作試驗。設計如表1所示5個處理。試驗小區面積為4 m×5 m，不同小區間設1 m隔離帶，每個處理3個重復，不同小區的土壤肥力狀況及管理方式相同。

1.4 土樣采集

于2017年7月中旬采集土壤樣品，處理按照“5點取樣法”，用土鉆分別取0～30 cm土層土樣，將所得土壤樣品裝入無菌塑料袋，做好標簽。除去雜質，均勻混合后，過1 mm篩，分為3份，一份帶回實驗室立即測定土壤酚酸類自毒物質和香豆素的含量，一份用于測定土壤肥力，一份土壤-4 ℃保存，用于測定土壤微生物。

表1 紫花苜蓿-玉米/小麥不同輪作處理 Table 1 The different treatments of alfalfa-crop/wheat rotation

1.5 試驗方法

1.5.1土壤化學性質測定 采用重鉻酸鉀法測定土壤有機質含量；采用凱氏定氮法測定土壤全氮含量；采用堿解擴散法測定土壤堿解氮含量；采用火焰光度法測定全鉀含量；先用醋酸銨浸提，再用火焰光度法測定土壤有效鉀含量；采用HClO4-H2SO4消煮法測定全磷含量；采用碳酸氫鈉浸提-鋁銻抗比色法測定有效磷含量[13]。

1.5.2土壤微生物測定 土壤微生物采用選擇性培養基涂布篩選法：細菌用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基，真菌用馬丁-孟加拉紅培養基，放線菌用改良高氏一號培養基，將土壤懸浮液按倍數(真菌10-3～10-1、放線菌10-5～10-3、細菌 10-6～10-4) 稀釋涂平板后置于28 ℃的恒溫培養箱中培養(細菌2～3 d、真菌4～5 d、放線菌5～7 d)后計數，3次重復[14-15]。

1.5.3土壤中酚酸類自毒物質測定方法 采用高效液相色譜(HPLC)法測定土壤中酚酸類自毒物質，對土壤中各酚酸和香豆素含量進行定性定量分析，待檢測的酚酸包括綠原酸、阿魏酸、咖啡酸、對羥基苯甲酸，香豆素。分析條件如下：高效液相色譜儀(Agilent 1100)，色譜柱(C18，PN 959990-902，5 μm，4.6 mm×250.0 mm)，流動相A：甲醇[16]。

1.6 數據統計

采用Microsoft Excel 2013軟件對數據進行處理和作圖；用SPSS 24.0進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，采用最小顯著差異法(LSD)比較數據組間的差異，用Person相關系數評價不同因子間的相關性。用SPSS 24.0統計軟件完成相關關系分析。

2 結果與分析

2.1 不同輪作處理對土壤養分的影響

紫花苜蓿輪作玉米和小麥后，土壤養分含量與CK相比均有不同程度的下降(表2)。輪作1年后，AC和AW的土壤有機質含量均顯著低于CK(P<0.05)，較CK降低了17.29%和19.85%；AC的土壤全氮含量較CK顯著減少了14.76%(P<0.05)；土壤全磷、全鉀、速效鉀含量在不同輪作處理之間差異不顯著(P>0.05)；AC和AW土壤堿解氮含量比CK顯著下降 23.82%和10.27%、速效磷顯著降低 14.05%、8.04%(P<0.05)，兩處理之間差異顯著。輪作第2年，土壤養分消耗持續增加，土壤養分含量持續下降，和輪作第1年的變化趨勢相近，輪作玉米對土壤有機質、全氮、堿解氮、速效磷的消耗量和輪作小麥相比顯著增多(P<0.05)。ACC和AWW的有機質含量較CK顯著降低了23.13%，26.23%(P<0.05)；ACC的全氮、全磷含量顯著低于CK(P<0.05)，較CK分別降低了18.52%，35.61%；和CK相比，AWW的全氮含量顯著減少了14.81%(P<0.05)；ACC和AWW土壤堿解氮含量比CK顯著下降 31.03%和42.55%、速效磷顯著降低8.93%、10.10%(P<0.05)。

表2 不同輪作處理條件下的土壤養分含量 Table 2 Contents of soil nutrients under the different grass-crop rotation treatments

注：同列不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)，下同。

Note:Different letters in the same column meant significant difference among treatments at 0.05 level, the same below.

2.2 不同輪作處理對土壤微生物的影響

紫花苜蓿與玉米、小麥輪作后土壤中微生物數量的變化如圖1所示，不同輪作處理顯著提高了土壤細菌的數量(P<0.05)，AC、ACC、AW、AWW比CK顯著增加了34.75%、42.62%、69.00%、138.00%，輪作后土壤細菌數量增量大小順序為AWW>AW>ACC>AC。紫花苜蓿輪作玉米、小麥后土壤真菌數量顯著降低(P<0.05)，AC、ACC、AW、AWW顯著低于CK，分別降低了48.96%、65.19%、66.72%、74.91%，而AW的土壤真菌數量與ACC之間差異不顯著(P>0.05)。放線菌數量的變化趨勢和細菌相同，AC、ACC、AW、AWW的土壤放線菌數量比CK顯著增加了3.90%、13.38%、217.30%、314.32%(P<0.05)。

2.3 不同輪作處理對土壤酚類自毒物質的影響

不同輪作處理下土壤酚酸類物質和香豆素含量如圖2所示，不同輪作處理下土壤自毒物質總含量顯著低于CK(P<0.05)，AC、ACC、AW、AWW較CK分別降低了10.76%、25.23%、17.49%、37.46%，表明輪作小麥對酚類自毒物質的降解作用比輪作玉米大。輪作1年后，AC土壤中的阿魏酸變化不明顯，綠原酸、咖啡酸、對羥基苯甲酸和香豆素含量比CK顯著下降(P<0.05)，AW土壤中對羥基苯甲酸和香豆素含量顯著低于AC(P<0.05)，其他自毒物質與CK相比差異不顯著(P>0.05)，說明紫花苜蓿與玉米、小麥輪作1年能夠減少土壤中自毒物質的含量，對羥基苯甲酸和香豆素的含量變化體現出輪作小麥比輪作玉米對土壤自毒物質的降解作用更大。輪作第2年，輪作土壤中的自毒物質含量均顯著低于CK(P<0.05)，且低于第1年輪作處理，說明輪作第2年對自毒物質的消減效果更強，除了阿魏酸、咖啡酸，AWW的其他自毒物質(綠原酸、對羥基苯甲酸、香豆素)含量均顯著低于ACC(P<0.05)，分別較ACC降低了19.62%、33.33%、12.50%。

2.4 土壤養分、土壤微生物數量和土壤自毒物質之間的相關性分析

2.4.1土壤養分與土壤微生物之間的相關關系 由表3可以看出，土壤中的細菌、放線菌與速效鉀呈極顯著負相關關系(P<0.01)，與有機質和全鉀呈顯著負相關關系(P<0.05)。真菌與有機質、堿解氮、速效磷、速效鉀呈極顯著正相關關系(P<0.01)，與全氮呈顯著正相關關系(P<0.05)。

2.4.2土壤養分與土壤自毒物質之間的相關關系 由表4可知，土壤速效磷、速效鉀和所有土壤自毒物質指標均呈極顯著正相關關系(P<0.01)，有機質與綠原酸呈顯著正相關關系(P<0.05)、與其他自毒物質指標呈極顯著相關(P<0.01)。除了綠原酸，堿解氮與其余自毒指標都具有顯著相關性(P<0.05)。

2.4.3土壤微生物數量與土壤自毒物質之間的相關關系 由表5可知，土壤中的細菌、真菌與所有自毒物質含量指標均具有顯著相關性(P<0.05)。放線菌只與綠原酸、對羥基苯甲酸、香豆素、自毒物質之和具有極顯著相關關系(P<0.01)。

表3 不同養分因子和3種微生物數量因子之間的相關性分析 Table 3 Simple correlation of soil nutrients and microorganism

*P<0.05,**P<0.01,下同。The same below.

表4 不同養分因子和不同自毒物質因子之間的相關性分析 Table 4 Simple correlation of soil nutrients and allelochemical

表5 3種微生物因子和不同自毒物質因子的相關性分析 Table 5 Simple correlation of soil microorganism and allelochemical

3 討論

3.1 自毒物質與連作

紫花苜蓿的種子、根、莖、葉、花的組織及殘根、枯枝落葉可以向土壤釋放一定量的次生代謝物質，阻礙紫花苜蓿自身的萌發和生長[12]，被稱為苜蓿的自毒作用。自毒作用是化感作用的種內形式，是作物產生連作障礙的原因之一。自毒現象直接影響紫花苜蓿草地的產量、管理、品質和經濟收入。酚酸類物質和香豆素是紫花苜蓿常見報道的自毒物質，酚酸類物質在土壤中積累也是造成很多植物連作障礙的主要原因[17]。土壤中自毒物質含量會直接影響植物的生長，本研究表明輪作玉米和小麥后土壤中自毒物質含量呈不同程度的降低，說明輪作對紫花苜蓿自毒現象有一定的緩解作用，促進后茬作物的生長，輪作1年后已經表現出緩解作用，第2年消減強度更大；輪作小麥對自毒物質含量的消減幅度高于玉米。

有學者認為土壤養分下降是導致連作障礙的主要原因[18]，但通過施肥來緩解連作障礙，效果并不顯著[19]。本研究發現紫花苜蓿輪作玉米、小麥后，土壤有機質、全氮、堿解氮、速效磷含量呈不同程度的下降，輪作玉米的消耗幅度顯著增強，說明種植玉米加大了對土壤有機質、全氮、堿解氮和速效磷的消耗，種植小麥能夠維持農田土壤肥力生長季平衡。研究報道土壤養分缺乏，植物會分泌更多的次生代謝物質[20]，但本研究發現輪作后土壤養分下降，土壤中酚酸類物質和香豆素含量也隨之減少，表明土壤養分不是導致連作障礙的主要原因。通過典型性分析表明，土壤養分和土壤自毒物質之間沒有顯著相關性。輪作后次生代謝物質降低可能是后茬作物和紫花苜蓿分泌的自毒物質發生互作作用，也可能是土壤微生物鈍化了自毒物質活性、改變了自毒物質的數量和種類。

3.2 土壤微生物與連作

自然條件下，在土壤中定殖著種類多樣、數量龐大的微生物，植物的生長發育都與其有著密切的關系，微生物群落結構的穩定對于預防土壤病害的發生有重要的作用。有研究顯示，連作作物的發病與其根際微生物群落結構失衡有關[21]，特別是與根際有益微生物和有害微生物的比例失衡有關[22]。本研究結果顯示，輪作可以提高土壤細菌、放線菌的數量，降低真菌的數量。這一結果與前人得出的結論吻合，甄文超等[15]的研究表明草莓(Fragariaananassa)根際病害發生后，其根際真菌增加，細菌和放線菌數量減少。另有Benizri等[23]對桃樹根部病害的研究也表明其發病與根際土壤中細菌的數量和種類降低、真菌的種類和數量提高有密切關系。綜上，連作障礙的發生實際是土壤微生物群落結構失衡的過程，而這一過程，涉及環境、土壤、植物及其根際微生物等多個因子之間的非常復雜的相互作用，土壤微生物在這一復雜系統中發揮著關鍵作用。因此從土壤微生態系統角度出發研究連作障礙的發生，能從根本上闡明連作障礙發生機制并采取相應的調控措施加以防治。

3.3 自毒物質與土壤微生物

由表5可以看出，自毒物質與土壤微生物存在密切的關系。事實上，植株不論通過何種途徑產生和釋放自毒物質，最終其中的絕大多數都將進入土壤中進行遷移和轉化。土壤微生物作為土壤自毒物質的循環調節者，是研究植株自毒作用活躍的生物因子[24]。土壤微生物主要通過對土壤中自毒物質進行代謝、降解以及利用來使其發生轉變[25]，相互之間存在著拮抗和促進作用，有些微生物能使自毒物質的種類和數量發生改變，而有些自毒物質能改變土壤微生物分布等。植物根際分泌的自毒物質能改變根際微生物的種類、數量和分布，如棕櫚酸使茄子(Solanummelongena)根際土壤中微生物數量和其組成比例發生變化，其中真菌降低，而細菌和放線菌升高[26]。微生物對自毒物質活性、轉化及在土壤中的持久性起重要作用[5]。研究表明土壤微生物能修飾自毒物質的活性，使一些自毒活性物質轉變為非活性物質，同時也能將沒活性的物質轉化為有活性的物質。同樣，由于土壤中存在的酚酸物質引起的自毒作用，可以通過微生物代謝來降低有毒酚酸濃度或有機殘余物中酚酸的釋放速度，進而影響自毒作用的持續時間和大小[26]。在紫花苜蓿輪作過程中，土壤微生物和自毒物質之間的互作關系是如何發生的，其機理是怎樣的，將是下一步研究的重點方向。

4 結論

5齡紫花苜蓿輪作玉米、小麥可有效降低土壤自毒物質綠原酸、咖啡酸、對羥基苯甲酸、阿魏酸、香豆素的含量，輪作第2年的消減自毒物質的效果強于第1年，同一年，輪作小麥的消減作用強于玉米。輪作后土壤微生物群落由真菌型向細菌型變化，土壤有機質、全氮、堿解氮、速效磷的消耗顯著增加，種植玉米對土壤有機質、全氮、速效氮和速效磷的消耗顯著強于種植小麥。結合輪作后土壤中自毒物質含量、土壤養分、土壤微生物的變化，得出紫花苜蓿輪作小麥能夠維持農田土壤肥力平衡，在半干旱地區多年生苜蓿草地向農田轉變過程中，以輪作小麥為宜，輪作1年小麥解毒效果明顯，輪作2年更佳。