血根堿通過PI3K/AKT信號通路減輕心肌缺血再灌注損傷

葉楨干，王雪靜

2.湖北省咸寧市中心醫院，湖北咸寧 437100

急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)已經成為世界范圍內發病率和死亡率最高的疾病之一。它是由于冠狀動脈血流的突然中斷，進而導致急性的心肌缺血壞死[1]。到目前為止，一些藥物及手術治療手段，如靜脈溶栓、經皮冠狀動脈介入及冠狀動脈旁路移植術等方法，可以恢復缺血區域的血流灌注，從而有效地緩解心肌缺血并減少梗死面積[2]。然而，再灌注過程可造成心肌細胞的額外損傷，即心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia and reperfusion injury, MIRI)。研究表明再灌注損傷所導致的心肌梗死面積約占最終總梗死面積的50%以上[3]。心肌缺血再灌注損傷的機制尚不十分清楚，炎癥、氧化應激、鈣離子超載、凋亡被認為是其重要的潛在病理機制[4-5]，但是目前針對MIRI的治療仍不理想。

血根堿是一種廣泛存在的二苯甲苯胺生物堿，主要提取自血根草的根中。血根堿具有多種生物學和藥理學活性：抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗凋亡等，因此引起了研究者的極大重視[6]。血根堿可以緩解脂多糖誘導的心肌細胞的炎癥反應，并抑制心肌細胞的凋亡[7]。因此，本研究將探究血根堿在心肌缺血再灌注損傷中的作用及其潛在的作用機制。報道如下。

1 材料與方法

1.1動物與實驗設計30只野生型SD大鼠(SPF級，體質量200～250 g)購自湖北省疾控中心。大鼠隨機分為3組并接受相應的處理：①假手術組(SO組)：左側開胸，左前降支(left anterior descending,LAD)下穿線不結扎；②I/R組：開胸結扎LAD 30 min，再灌注2 h；③血根堿+I/R組(I/R+ SAN組)：缺血30 min后，通過鼠尾靜脈用微量注射器注射血根堿(50 mg·kg-1)，然后再灌注2 h(使用含有0.05% Tween-80的生理鹽水溶解血根堿)。大鼠心肌缺血再灌注損傷模型構建方法如下：術前12 h，大鼠禁食不禁飲。腹腔注射戊巴比妥鈉(60 mg·kg-1)麻醉大鼠，仰臥位固定。氣管插管連接小動物呼吸機給予人工通氣(70次·min-1)。在四肢皮下置入不銹鋼電極連接心電圖，監測標準Ⅱ導聯的心電圖變化。左側開胸暴露心臟，輕輕挑去心包膜。在左心耳與動脈圓錐之間使用6-0絲線在LAD下穿線，在LAD上表面放置一根中部帶有凹槽的小聚乙烯管，輔助結扎并保護LAD。以標Ⅱ導聯ST段抬高或結扎血管供血區域，心臟顏色由紅潤變紫紺表明心肌缺血成功。缺血30 min后剪斷結扎線，恢復血流灌注2 h。

1.2心肌組織病變的觀察摘取心臟組織，置于4%多聚甲醛溶液中進行固定，然后進行石蠟包埋、切片(厚度為5 μm)，行常規HE染色，通過光學顯微鏡觀察心肌組織病理形態學改變。

1.3乳酸脫氫酶和肌酸肌酶同工酶的檢測再灌注2 h結束后，經頸靜脈取血，3 000 r·min-1離心15 min，提取上清，全自動生化分析儀測定肌酸肌酶同工酶(creatine kinase,CK)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)水平。具體操作步驟參照試劑盒說明書(南京建成生物工程研究所)。

1.4心肌組織中IL-6、TNF-α的檢測實驗結束后，將大鼠處死后取各組心肌組織，按照ELISA試劑盒的說明檢測炎癥因子IL-6和TNF-α的表達，使用分光光度計讀取各組的吸光度值。

1.5免疫印跡技術檢測蛋白的表達Western blot檢測各組AKT和p-AKT的蛋白表達水平。使用裂解液(碧云天)裂解心肌組織，離心取上清提取總蛋白。BCA試劑盒(碧云天)檢測蛋白濃度。采用10%聚丙烯酰氨凝膠電泳分離蛋白，然后轉移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶封閉90 min，AKT (Cell signaling, #2938)和p-AKT (Abcam, ab32509) 及GAPDH (Abcam, ab181602) 相對應的抗體4 ℃孵育過夜，之后二抗室溫繼續孵育1 h。化學發光法顯影蛋白條帶，使用Image Lab 軟件分析目標蛋白的灰度值，以GAPDH為內參標化檢測蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1心肌組織的病理在假手術組中，心肌纖維完整且排列規則，心肌細胞形態完整、結構清晰，未發現胞核固縮、壞死及炎癥細胞的浸潤。在I/R組中，可見心肌纖維部分斷裂且排列紊亂，細胞破裂、溶解，核固縮、核溶解、細胞間質水腫和炎癥細胞浸潤。而SAN+I/R組盡管出現心肌纖維腫脹、萎縮和小部分斷裂，但是心肌細胞結構和形態基本保持正常，見圖1。

2.2血清LDH和CK的水平I/R組血清中LDH和CK的水平較SO組明顯增加(P<0.05)。血根堿預處理組顯著降低了缺血再灌注所引起的LDH和CK-MB水平的增加(P<0.05)，見圖2。

2.3心肌組織炎癥因子IL-6、TNF-α的表達水平ELISA結果顯示，缺血再灌注損傷后，炎癥因子IL-6、TNF-α的水平顯著提升(P<0.05)，血根堿預處理可以顯著抑制炎癥因子的表達(P<0.05)，見圖3。

SO:假手術組；IR:缺血再灌注組；IR+SAN:IR+血根堿圖1 血根堿對心肌病理的影響

A:LDH水平；B:CK-MB水平。①與SO組比較，P<0.05;②與SO或I/R組比較，P<0.05圖2 血根堿對血漿中LDH和CK-MB水平的影響

A:IL-6水平；B:TNF-α。①與SO組比較，P<0.05;②與SO或I/R組比較，P<0.05圖3 血根堿對心肌組織中IL-6和TNF-α表達的影響

2.4血根堿對心肌組織PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT蛋白表達的影響Western blot 結果表明，再灌注過程中心肌組織中p-PI3K和p-AKT的蛋白水平明顯下降；血根堿預處理后p-PI3K、 p-AKT的蛋白水平相對于I/R組顯著升高(P<0.05)；各組中PI3K和AKT的表達無顯著差異(P>0.05)。見圖4。

A:PI3K蛋白表達水平;B:p-PI3K蛋白表達水平;C:AKT蛋白表達水平;D:p-AKT蛋白表達水平。①與SO組比較，P<0.05；②與SO或I/R組比較，P<0.05。圖4 血根堿對心肌組織中AKT和p-AKT表達的影響

3 討論

目前為止，最為快速有效治療AMI 的方式是早期成功地再灌注心肌[2]。然而隨之而來的再灌注損傷在很大程度上抵消了其有益作用。雖然在再灌注損傷的病理生理機制上已經取得很大進展，但是仍然缺乏理想的措施緩解其不利影響。炎癥反應被認為在心肌缺血再灌注損傷中發揮著關鍵作用。研究表明，在心肌缺血再灌注損傷過程中，炎癥反應導致的損傷貫穿于心肌細胞損傷的全過程，且能夠與其他可能參與心肌缺血再灌注損傷的機制(如氧化應激、細胞凋亡等機制)互相作用，是十分活躍的中間媒介[8]。

PI3K/AKT信號通路是一個廣泛存在的信號通路，已經被證實參與多種細胞生物過程[9]。AKT是PI3K下游最重要的中心調節分子，其活化形式磷酸化的AKT(p-AKT)，可以進一步與關鍵的炎癥相關分子發生作用，對細胞產生強大的保護作用[10]。之前大量的研究已經證實，PI3K/AKT信號通路的激活，可以顯著減輕炎癥反應，從而緩解心肌缺血再灌注損傷。Li等[11]的研究發現橙皮苷預處理，可以通過激活PI3K/AKT信號通路，抑制下游關鍵炎癥分子HMGB1的表達，從而對心肌發揮保護作用。而使用該信號通路的特異性抑制劑LY294002后可以阻斷這一作用。黃仁彬等[12]同樣發現，通過激活PI3K/AKT信號通路，可以顯著減少TNF-α炎癥分子的表達水平，從而緩解心肌缺血再灌注損傷。最新的研究表明，血根堿可以顯著緩解脂多糖誘導的心肌炎癥反應，并可以顯著抑制IL-6、TNF-α等關鍵炎癥因子的表達，表現出強大的抗炎作用[7]。因此，推測血根堿可能通過減輕炎癥反應進而緩解心肌缺血再灌注損傷。

血根堿擁有多重有益于健康的藥物功效，研究者已經證實血根堿在白血病、腫瘤、氣道重構、心肌肥厚以及心肌炎等的治療中，具有強大的治療作用[13-14]。然而，血根堿是否可以在心肌缺血再灌注損傷中發揮積極作用尚不清楚。因此，在本研究中，作者構建了大鼠心肌缺血再灌注損傷模型進行探究。本研究結果表明，給予50 mg·kg-1的血根堿處理后，可以顯著減輕缺血再灌注損傷導致的心肌損傷，表現為血根堿可以顯著緩解再灌注損傷導致的心肌形態學改變，降低再灌注后血漿中LDH和CK-MB的水平，并降低由再灌注損傷誘導的炎癥因子IL-6和TNF-α表達的升高。同時，再灌注損傷引起的PI3K/AKT信號通路的抑制得以顯著緩解，具體表現為，與模型組相比血根堿處理后可以顯著上調p-PI3K和p-AKT蛋白的表達。由此可見，血根堿有可能成為緩解心肌缺血再灌注損傷的有效治療手段。

綜上所述，血根堿可以緩解心肌缺血再灌注損傷，這種保護作用可能與其激活PI3K/AKT信號通路從而減輕炎癥反應有關。