DTT誘導線粒體應激引起膠質瘤細胞凋亡的機制研究

周子薦,沈璐妍,劉遠達,全成實*

(1.吉林大學 臨床醫學院，吉林 長春130021;2.吉林大學 基礎醫學院病理生理學系; 3.吉林大學第二醫院 胃腸營養及疝外科)

研究表明，膠質瘤細胞對化療藥的敏感性與其細胞內部發生的內質網應激有著十分密切的關聯[1]。在化療藥物的作用下，腫瘤細胞內質網穩態受到破壞，蛋白質無法折疊或錯誤折疊，引起內質網應激[2]。DTT(二硫蘇糖醇)是一種內質網應激誘導劑，可阻止蛋白質中的半胱氨酸殘基的氧化，干擾PDI(二硫鍵異構酶)在蛋白質二硫鍵形成中的催化作用，導致錯誤折疊的蛋白大量堆集[3]，從而誘發內質網應激。因此，本實驗選用DTT誘導腦膠質瘤細胞系SHG44產生內質網應激，并進行線粒體應激相關指標、線粒體ROS水平和細胞凋亡蛋白檢測。

1 材料與方法

1.1細胞、主要試劑與儀器人腦膠質瘤細胞系SHG44，購于上海子實生物公司。二硫蘇糖醇(DTT)購自北京coolaber公司，Caspase-3 活性檢測試劑盒購自上海碧云天公司。GRP78蛋白抗體購自proteintech公司；CHOP購自abcam公司；β-actin、PDI、HSP10、HSP60、ClpP、LON、Htr A2/Omi抗體、HRP標記的山羊抗兔IgG二抗和HRP標記的山羊抗小鼠IgG二抗購自Santa Cruz公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養及處理 細胞培養:使用10%胎牛血清的低糖DMEM培養基置于37℃，5%CO2細胞培養箱中培養，保持飽和濕度。細胞培養每3天進行一次傳代，細胞使用0.01M PBS沖洗一次，0.25%胰酶細胞消化，并按照1∶3的比例進行傳代。藥物處理：取對數期生長細胞，設置空白對照組和實驗組，實驗組采用DTT(5 μmol/ml)分別處理3 h，6 h，12 h及24 h。

1.2.2MTT比色法檢測 96 孔板接種為1.0×104細胞/孔，細胞用含10%小牛血清的正常培養液混勻，每孔終體積為100 μl，5% CO2、37℃培養箱孵育過夜。設置3個陰性對照組，每個實驗組設3個復孔，按實驗所需加藥物處理，每孔終體積為100 μl。到作用時間點結束后，再往每孔加入10 μl MTT，孵育4-6 h后棄去培養液，每孔加入150 μl DMSO。孔板在平板振蕩器上振蕩 5-10 min。酶標儀490 nm波長測取吸光度值，記錄結果，計算抑制率或存活率。

1.2.3細胞線粒體ROS水平檢測 細胞接種于6孔板上，分組處理同1.2.1。以1∶1000 Mito-SOX Red染色30 min，消化、收集細胞，充分洗滌后用流式細胞儀檢測。

1.2.4Western Blot 消化、收集處理的細胞，加入RIPA細胞裂解液，裂解充分后以14 000 g、4℃離心20 min，取上清為細胞總蛋白，采用BCA試劑盒進行蛋白濃度定量后，使用裂解液調平后，按照1∶4體積比例加入5×Loading Buffer，100℃煮沸 10 min。根據BCA蛋白定量結果計算樣品的上樣量，每孔總蛋白25 μg，選用12% SDS-PAGE凝膠和Tris-甘氨酸電泳緩沖液電泳，室溫穩壓100V電泳。采用濕轉法將蛋白轉于PVDF膜上，室溫下5%脫脂奶粉封閉搖床2 h，TBST洗膜，加入按要求稀釋的對應的單克隆抗體，4℃封閉孵育過夜。TBST洗膜，加入二抗室溫搖床孵育2 h，TBST洗膜后，發光、凝膠成像系統拍照，結果采用Quantity One軟件進行量化分析。

1.2.5Caspase 3活性檢測 使用碧云天公司的Caspase-3活性檢測試劑盒，按照試劑盒提供的說明書操作規范步驟，檢測細胞裂解液中Caspase-3酶活性。

P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1DTT對腦膠質細胞瘤系SHG44細胞活性及凋亡的影響

實驗結果如圖1，通過MTT法檢測DTT對細胞增殖能力的影響，研究發現高濃度的DTT可以抑制膠質瘤細胞增殖能力;凋亡執行蛋白Caspase-3活性逐漸上升(P<0.05)。

2.2DTT對腦膠質瘤內質網應激相關蛋白的影響

與對照組相比，PDI表達量較對照組逐步下降(P<0.05)，GRP78/Bip的表達有顯著升高，且表達的升高呈時間依賴性(P<0.05);CHOP表達水平相對于對照組隨藥物處理時間延長逐漸上升(P<0.05)，如圖2。

A：MTT檢測結果量化圖；B：Caspase 3活性檢結果量化圖(*表示與con組相比，具有統計學意義，*P<0.05)。

A：內質網應激相關蛋白Western blot條帶圖；B：GRP78蛋白水平量化圖；C：PDI蛋白水平量化圖；D：CHOP蛋白水平量化圖(*表示與con組相比，具有統計學意義，*P<0.05)。

2.3DTT對腦膠質瘤線粒體內ROS及線粒體應激相關蛋白的影響

實驗結果顯示，線粒體內部ROS水平呈時間依賴性升高(P<0.05)，如圖3。與對照組相比，熱休克蛋白10在3 h表達量最高，隨后表達逐漸下降。熱休克蛋白60以及蛋白水解酶LON,ClpP等與對照組相比都呈現出逐漸上升趨勢(P<0.05)，在到6 h達高峰后表達開始逐漸下降。且以上熱休克蛋白，蛋白水解酶在24 h組表達水平均低于對照組的表達量(P<0.01)。Omi的表達量則逐漸下降(P<0.01)，如圖4。

3 討論

腦膠質瘤作為成人中樞系統最常見的惡性腫瘤，具有極高的侵襲性，手術難以將其徹底清除。膠質瘤的較強的增殖能力使其常常處于缺氧、營養缺乏等多種不利環境中，為應對這些不利因素，膠質瘤細胞會啟動各類應激反應來重建細胞穩態[4]。近年來發現，內質網應激可通過激活未折疊蛋白反應的ATF6，IRE1和 PERK信號通路參與腫瘤化療藥物的耐藥機制[5]。然而過度的內質網應激也可以激活PERK-eIF2α-ATF4信號途徑下游分子CHOP的表達增加，增加凋亡基因表達，促使細胞凋亡[6]。

A：對照組；B：DTT處理3 h后；C：DTT處理6 h后；D：DTT處理12 h后

A：線粒體應激相關蛋白Western blot條帶圖；B：HSP10蛋白水平量化圖；C：HSP60蛋白水平量化圖；D：ClpP蛋白水平量化圖；E：LON蛋白水平量化圖；F：Omi蛋白水平量化圖(*表示與con組相比，具有統計學意義，*P<0.05，* *P<0.01)。

在本研究中，隨著DTT處理SHG44細胞時間的增加，PDI的水平逐漸下降(圖2 C)。內質網應激標志性蛋白GRP78的表達逐漸增加(圖2 A)。表明DTT抑制了PDI表達，干擾了內質網中蛋白二硫鍵形成，進而誘導了內質網應激。同時隨著DTT處理時間的延長，信號通路PERK-eIF2α-ATF4下游分子CHOP的表達在逐漸上升(圖2 C)，凋亡蛋白Caspase-3的活性也逐漸升高(圖1 A)。由此可見，DTT可誘導腦膠質瘤細胞產生內質網應激，并可通過激活CHOP表達，誘導細胞凋亡。

內質網與線粒體不僅存在物理上的連接，兩者在Ca2+信號傳遞、脂質轉運、線粒體分裂融合以及能量代謝等功能上也有著極其緊密的聯系[7]。內質網應激后可引起內質網腔中錯誤折疊和未折疊蛋白的聚集，破壞內質網內Ca2+動態平衡，致使線粒體鈣超載，增加了線粒體中ROS的產生[8,9]。大量ROS可以引起線粒體內部的未折疊蛋白堆積，發生線粒體應激反應[10]。本實驗結果顯示，在DTT作用下，線粒體內部的ROS水平隨著應激水平上升而不斷上升(圖3)。表明線粒體內部已經無法處理其內部大量的ROS，線粒體自身功能已經遭到嚴重損害。

線粒體內部存在多種分子伴侶，它們可以通過各種方式的組合幫助線粒體內多肽正確折疊。線粒體基質蛋白折疊和修復系統的關鍵組成部分是由2個HSP60七聚體和1個HSP10七聚體所組成的高分子量聚合物[11]。在線粒體應激時，HSP10、HSP60的表達會增加，以此減少線粒體內部的未折疊蛋白來維持線粒體的穩態[12]。因此在本研究中我們使用HSP10和HSP60作為衡量線粒體應激程度的指標。結果顯示，隨著DTT作用時間延長，HSP10與HSP60都呈現了先上升后下降的趨勢(圖4 B、C)。因此我們認為在腦膠質瘤細胞中，內質網應激可誘發線粒體應激，并且隨著內質網應激加劇，線粒體未折疊蛋白反應不足以使線粒體恢復正常功能，線粒體處于功能失代償狀態，進而線粒體應激指標表達下降。

為了進一步評價對于線粒體應激水平，我們又檢測了相關的線粒體蛋白水解酶表達變化。ClpP是位于線粒體基質中的一種包含絲氨酸蛋白酶催化三聯體結構域的蛋白水解酶,可利用ATP提供的能量將蛋白底物去折疊,對蛋白進行降解[13]。同樣定位于線粒體基質的Lon也屬于作為絲氨酸蛋白酶家族成員,可以對疏水氨基酸的末端進行水解，通過介導異?；驌p傷的蛋白和短暫調控蛋白的降解來維持線粒體的蛋白穩態[14]。結果所示，隨著DTT作用時間延長，蛋白酶ClpP和LON總體上也呈現出了先上升后下降的趨勢(圖4 D、E)。而定位在線粒體內膜間隙的HtrA2/Omi 是一種寡聚絲氨酸蛋白酶，在內質網合成后，由線粒體定位序列 MTS引導進入線粒體中，并儲存在線粒體膜間隙。它能夠識別錯誤折疊蛋白暴露出來的疏水表面，發揮分子伴侶的功能[15]。在本實驗結果中，Omi蛋白從3 h就已經開始呈現下降趨勢(圖4 F)。這說明內質網應激確實誘導了線粒體應激，并且線粒體內膜間隙蛋白穩態失衡的發生可能先于線粒體基質蛋白穩態失衡。

綜上，我們認為內質網應激可誘導線粒體應激，且線粒體應激可能存在一個代償閾值，超過此閾值會使線粒體穩態失衡，其具體表現為分子伴侶水解酶的表達下降以及蛋白水解酶釋放等，進而促進細胞凋亡的發生。因此，線粒體應激在內質網應激誘導細胞凋亡中具有重要作用，進一步研究線粒體應激在內質網應激誘導細胞凋亡中的作用為腦膠質瘤的化療藥物提供了新治療策略和研究靶點。