仇業鵬 張庭然
1. 重慶師范大學體育與健康科學學院,重慶 401331 2. 西南大學體育學院,重慶 400715
在《美國醫學會雜志》 (The Journal of theAmerican Medical Association,JAMA)和《新英格蘭醫學雜志》 (The New England Journal of Medicine,NEJM)等權威期刊頻頻刊登代謝綜合征 (metabolic syndrome, MS) 相關研究[1-2]。在流行病學領域MS亦是研究熱點[3]。MS是多種代謝成分紊亂集中體現的病理狀態,主要包括糖、脂類、蛋白質、尿酸和骨代謝紊亂等,MS能夠顯著加速肥胖、高血脂、高血壓、2型糖尿病進程,同時會大幅度增加心腦血管疾病的患病風險[4-5]。Daudt、Lim等[6-7]研究表明,絕經期女性被認為MS 的易感人群,MS在絕經期婦女中患病率約為33%~42%。MS中高血壓、糖尿病、心腦血管等表現由于其直接的危險性和危害性受到較高的關注,相關研究也較多。而肥胖和骨代謝異常由于其危害性需要較長時間的積累方能顯現,所以受關注程度較低。婦女絕經后由于雌性激素水平下降,體內激素環境呈現明顯改變,絕經婦女經常出現內臟脂肪和皮下脂肪的堆積增加,從而導致肥胖的發生,與肥胖伴生的高血脂癥則是心腦血管疾病的重要危險因素。女性進入絕經期,由于雌激素下降,骨量流失加劇,髖部、股骨和腰椎等位置骨量流失較為嚴重,容易出現骨質疏松現象。絕經期女性往往會伴隨肥胖高血脂與骨質疏松發生。有研究認為這可能與雌激素下降和皮質醇上升有關[2]。適量運動被認為能夠有效改善骨質,增加骨密度。而運動減肥一直以來是最被推崇的科學減肥方法。但是通過跑步改善骨量和骨密度,一般要連續運動35周以上才能實現[4]。在降低血脂方面,美國運動醫學會的運動處方指南中提到,中低強度跑步運動同時配合清血脂類膳食添加劑降低血脂作用會顯著優于單純跑步[8]。銀杏葉提取物(Ginkgo biloba extract,GBE)是一種應用廣泛的傳統中藥,主要有效成分為是銀杏萜內酯類化合物和黃酮類化合物,GBE因其具有抗氧化、改善缺血心肌功能等功效,已被應用于心腦血管疾病治療[9-10]。但隨著有關GBE研究深入,發現GBE的應用遠不止于此。有研究顯示GBE能夠顯著提升骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化,同時能夠抑制骨髓間充質干細胞向脂肪細胞分化[11]。進一步研究發現攝入GBE對骨質疏松大鼠的成骨有促進作用,可以加速骨小梁的形成,增強骨密度[12]。也有研究顯示GBE能夠明顯降低大鼠血清總膽固醇水平,并且夠緩解高脂飲食導致的心血管炎癥[13]。但目前將運動聯合GBE攝入對人或動物降低血脂或改善骨健康的研究尚少。但運動和GBE在降低血脂或改善骨健康方面具有類似作用,聯合使用有可能形成疊加效應,從而增加治療效果或者縮短治療時間。因此,本研究將跑步運動配合銀杏葉提取物攝入作為干預方案,以去卵巢肥胖骨質疏松大鼠為研究對象,探討跑步運動配合銀杏葉提取物攝入對骨密度、血脂和抗氧化能力的影響。為探索改善絕經期肥胖骨質疏松婦女的骨健康、脂代謝提供有效參考。
1.1.1實驗動物:本實驗從重慶醫科大學下屬動物實驗中心(SCXK(渝) 2017-0023)購得12周齡未經產SPF級健康雌性Sprague Dawley(SD)大鼠80只,體重為(270.4±18.6)g。所有SD大鼠進行分籠飼養,大鼠自由飲水飲食,在適應期飼養期間,飼料采用符合國家標準嚙齒類動物飼料進行喂食,動物房內溫度保持22~25 ℃,相對濕度保持45%~55%,明暗分期為12/12 h,所有大鼠實驗前均未在動物跑臺上進行過運動。本研究中對實驗動物處理完全符合我國科學技術部辦公廳2004年發布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。
1.1.2實驗試劑:GBE(總黃酮醇苷含量26.2%、萜類內酯含量為7.8%)由江蘇金納多生物科技有限公司生產,配置過程時稱取GBE,將銀杏葉提取物溶解于生理鹽水中(50 g /L)并且進行2 min研磨混懸,在4 ℃ 避光保存。戊巴比妥鈉,上海信裕生物科技有限公司生產。青霉素鈉,河北石家莊制藥集團四廠生產。大鼠骨鈣素(OC) 檢測試劑盒-ELISA檢測試劑盒,美國R&D Systems生物科技有限公司生產。大鼠抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP) 檢測試劑盒-ELISA檢測試劑盒,美國R&D Systems生物科技有限公司生產。雌二醇(E2)檢測試劑盒-ELISA檢測試劑盒,美國R&D Systems生物科技有限公司生產。丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒-ELISA檢測試劑盒,美國R&D Systems生物科技有限公司生產。超氧歧化酶(superoxide dismutase, SOD)檢測試劑盒-ELISA檢測試劑盒,美國R&D Systems生物科技有限公司生產。谷胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)檢測試劑盒-ELISA檢測試劑盒,過氧化氫酶(catalase, CAT)檢測試劑盒-ELISA檢測試劑盒,美國R&D Systems生物科技有限公司生產。
1.1.3實驗設備:美國Johnson&Johnson 公司DT-60Ⅱ型血液分析儀,上海分析儀器公司UV-8000ST觸屏版雙光束紫外可見分光光度計,日本日立公司HITACHI-7000全自動生化分析儀,湖南湘儀集團CTK-130C低溫離心機,美國AWARENESS 公司Statfax 4200 酶標儀,韓國InAlyzer公司DXA雙能 X 線骨密度儀,江蘇賽昂斯公司SA109動物跑臺。
1.2.1實驗設計:第1步:購回SD大鼠后,進行1周適應性籠內飼養,自由飲食。第2步:將大鼠隨機分為去卵巢高脂組和對照組,去卵巢高脂組進行卵巢切除手術,對照組進行假手術,術后去卵巢高脂組進行高脂飼料喂食,對照組進行正常喂食,共進行6周,將接受切除卵巢手術和高脂喂食的的大鼠又隨機分為模型組、銀杏葉組、運動組、銀杏葉+運動組,接受假手術和正常喂食的大鼠歸為假手術組。第3步:進行12周干預,干預方案見表1。第4步:全部干預結束后,將各組大鼠分組置入代謝籠,采集24 h的尿樣,尿樣采集結束后,進行大鼠的腹腔靜脈取血,對大鼠進行骨掃描、血液生化指標檢查、骨代謝標志物檢查。
1.2.2制造動物模型:大鼠適應性飼養結束后,將大鼠隨機分為切除卵巢高脂喂食組(ovariectomized,OVX組)和對照組,數量分別為60只和20只。將80只SD大鼠利用50 mg /kg戊巴比妥鈉(0.1 g/kg)進行腹腔注射麻醉,剔除體毛,在大鼠脊柱左右側剪開背部肌肉約1.5 cm切口,對大鼠進行卵巢切除,對照組大鼠只切除卵巢附近脂肪組織。最后利用可被大鼠自體吸收的羊腸線進行刀口縫合,完成手術后對大鼠腹腔注射80萬IU/kg青霉素鈉,1次/d,連續注射7 d,以防出現術后感染。術后切除卵巢高脂喂食組進行高脂飼料喂食,對照組進行正常飼料喂食,進行6周干預。本次造模中被切除卵巢和高脂喂食的60只大鼠均存活、精神良好,全部造模成功。假手術正常喂食的20只大鼠,全部存活且狀態良好。
1.2.3分組方案:術后6周后,停止高脂飼料喂食,進行正常飼料喂食。將進行假手術正常飼料喂食處理的對照組的20只大鼠定為假手術組(sham-operated,SO組,n=20);接受去卵巢手術高脂飼料喂食的大鼠隨機分為模型組(model,M組,n=15)、跑步運動組(run,R組,n=15)、GBE組(Ginkgo biloba extract,G組,n=15)、GBE+跑步運動組(Ginkgo biloba extract+run,GR組,n=15)。其中G組按照100 mg /(kg·d)灌胃給予相應的藥物,正常飼養不進行運動,GR組與G組采用相同給藥方式并進行運動,R組、S組、M組按與G組相同體積0.5% CMC-Na進行灌胃,其中R組每天進行與GR組相同運動,S組、M組進行正常飼養,不運動。所有實驗大鼠每天灌胃1次,每周灌胃6 d,連續給藥12周。在12周干預后所有大鼠皆存活,未出現死亡,且精神狀態良好。
1.3.1觀測大鼠健康及生活狀態指標:自大鼠購回后,專人觀察所有大鼠適應狀況、大鼠術后傷口恢復、精神、飲食、體重、排泄等狀況,每周記錄大鼠體重。
1.3.2骨密度、骨代謝檢測指標:①12周干預結束后,本研究利用韓國InAlyzer-DXA雙能 X 線骨密度檢測儀中RCP活體小動物掃描模式對大鼠左腿股骨進行檢查。②12周干預結束對大鼠進行后腹腔采血,常溫(22 ℃)下血樣靜置1 h,利用低溫高速離心機,在4 ℃下對血液以4 000 r/min 離心8 min。利用酶聯免疫法-ELISA檢測血清骨鈣含量(osteocalcin,OC)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)水平;利用生化分析儀檢測血清中鈣(Ca)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、磷(P)水平。
1.3.3激素、血脂、抗氧化指標檢測: 本研究大鼠經12周實驗干預后,在24 h內,通過腹腔取血采集約20 mL的血樣,并保存于EDTA 抗凝采血管中,按

表1 分組方案表Table 1 Grouping scheme
次序進行編號,利用低溫高速離心機,在4 ℃下對血液以4 000 r/min 離心8 min。采用酶聯免疫法-ELISA酶法檢測血清雌二醇(Serum estradiol,E2)、檢測丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)、過氧化氫酶(catalase,CAT)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)的水平。利用全自動血液分析儀、紫外分光度儀檢測血清總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三脂(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol LDL-C)。
本研究利用SPSS18.0統計軟件進行數理統計分析。通過描述性分析、多因素方差分析檢驗運動因素和攝入銀杏葉提取物因素對大鼠各項指標的影響。檢測中,當交互作用具有統計學意義,則進行Tukey method檢驗。本文設置顯著水平為α=0.05。
大鼠體重變化結果見表2。

表2 大鼠體重變化(g,n=80)Table 2 Changes in body weight (g,n=80)
注:假手術組(S組)、模型組(M組)、運動組(R組)、銀杏組(G組)、銀杏運動組(GR組);與S組比較,aP<0.05;與M組比較,bP<0.05。
表2顯示:①在購回進行適應性飼養后,大鼠體重組間差異并無統計學意義,P>0.05;②手術后6周,進行干預前,去卵巢高脂喂食的M組、R組、G組、GR組大鼠體重顯著高于S組大鼠;說明肥胖大鼠模型構建成功;③在干預后3、6、9、12周M組大鼠體重顯著高于S組,P<0.05,R組、G組、GR組大鼠體重有逐漸上升趨勢,但是在3、6、9、12周均顯著低于M組,P<0.05。④當干預進行至第9周、第12周R組與GR組大鼠體重高于S組但差異無統計學意義,P>0.05。
大鼠骨密度和雌二醇測量結果見表3。

表3 各組骨密度和血清雌二醇水平測試結果(n=80)Table 3 Comparison of BMD and E2 among groups(n=80)
注:與S組比較,aP<0.05;與M組比較,bP<0.05。
表3顯示:①M組大鼠BMD、血清E2水平顯著低于S組大鼠,P<0.05。②R組、G組GR組大鼠BMD、血清E2水平顯著高于M組(P<0.05),雖低于S組,但差異無統計學意義,P>0. 05,GR組BMD、血清E2水平高于R組、G組,但差異無統計學意義,P>0.05。
大鼠骨質代謝測量結果見表4。

表4 OC、ALP、DPD /Cre、Ca、P結果(n=80)Table 4 Measuring result of OC, ALP, DPD / Cre, Ca, P(n=80)
注:與S組比較,aP<0.05;與M組比較,bP<0.05。
表4顯示:①M組大鼠血清OC、ALP、尿液DPD/Cre、Ca/Cre、P/Cre水平顯著高于S組、R組、G組和GR組,P<0.05。S組大鼠血清OC、ALP、尿液DPD/Cre、Ca/Cre、P/Cre水平與R組、G組、GR組差異不具有統計學意義,P>0.05。②大鼠血清Ca、P水平方面,M組、S組、R組、G組、GR組組間差異無統計學意義,P>0.05。
氧化指標測量結果見表5。

表5 大鼠血清CAT、GSH-PX、MDA、SOD測量結果(n=80)Table 5 Measuring result of CAT、GSH-PX、MDA、SOD(n=80)
注:與S組比較,aP<0.05;與M組比較,bP<0.05;與R組比較,cP<0.05;與G組比較,dP<0.05。
表5顯示:①M組大鼠MDA水平顯著高于S組、R組、G組和GR組,P<0.05;S組大鼠MDA水平顯著低于與R組、G組、GR組,P<0.05,R組、G組、GR組組間差異不具有統計學意義,P>0.05。②M組大鼠CAT、GSH-PX水平顯著低于S組、R組、G組和GR組,P<0.05;S組大鼠CAT、GSH-PX水平顯著高于與R組、G組、GR組,P<0.05,GR組大鼠CAT、GSH-PX水平顯著高于與R組、G組,P<0.05, R組、G組組間差異不具有統計學意義。③M組大鼠SOD水平顯著低于S組、R組、G組和GR組,P<0.05;S組、R組、G組和GR組組間差異則無統計學意義,P>0.05。
大鼠血脂測量結果見表6。
表6顯示:①M組大鼠血液TG、TC水平顯著高于S組、R組、G組和GR組,P<0.05;S組大鼠血液TG、TC水平顯著低于與R組、G組,P<0.05,但與GR組比較差異不具有統計學意義,P>0.05。

表6 血脂測量結果Table 6 Measuring result of blood lipid(mmol/L)
注:與S組比較,aP<0.05;與M組比較,bP<0.05。
②M組大鼠血液LDL-C水平顯著高于S組、R組、G組和GR組,P<0.05;S組大鼠血液LDL-C水平與R組、G組、GR組比較,差異不具有統計學意義,P>0.05。
流行病學研究顯示MS在女性絕經后發病率升高,其中絕經后骨質疏松和中老年肥胖是其中重要表征[2]。骨質疏松(OP)是一種多原因引發的骨量丟失、骨結構退化導致骨脆性增加的全身性骨代謝疾病[6]。骨質疏松主要分為原發性骨質疏松和繼發性骨質疏松,原發性骨質疏松占大多數,原發性骨質疏松又分為老年性骨質疏松、絕經后骨質疏松、特發性(少年)骨質疏松。其中絕經后骨質疏松較為常見,其原因主要是絕經后卵巢功能退化、機體雌激素水平降低,骨代謝升高、骨量流失加劇。同樣由于雌激素水平下降,導致脂代謝速率降低,血脂、內臟脂肪、皮下脂肪堆積,所以中老年女性肥胖和高血脂較為常見[14]。本研究利用未經產的雌性SD大鼠進行雙側卵巢摘除和高脂喂食建立絕經骨質疏松并發肥胖模型,通過跑步運動聯合銀杏葉提取物攝入進行12周干預,研究該方案對去卵巢骨質疏松并發肥胖大鼠骨密度、骨代謝、脂代謝、抗氧化相關指標的影響。
本研究中在進行干預前去卵巢手術聯合高脂喂食的M組、R組、G組、GR組大鼠體重顯著高于S組大鼠,M組、R組、G組、GR組大鼠體重與先前有關肥胖大鼠模型的研究中大鼠數據比較后發現肥胖大鼠模型構建成功。但過去的研究中一般高脂喂食大鼠的模型建立[15],需要8~12周,但本研究6周模型建立成功,這可能與本研究使用去卵巢大鼠有關,大鼠去卵巢后,雌激素水平下降,骨量流失增加,機體出于代償機制,刺激體重增加。在此機制作用下,結合高脂喂食,導致肥胖大鼠模型形成較快。本研究發現在干預過程中R組、G組、GR組大鼠體重雖然仍呈上升趨勢,但其上升速度顯著低于M組,所以可以認為跑步干預、攝入GBE干預、跑步+GBE干預能夠降低肥胖的發生,在干預的第12周R組與GR組大鼠體重高于S組,但差異無統計學意義,表明跑步運動是體重變化的主要影響因素。
骨質疏松癥的成因復雜,其中成骨細胞與破骨細胞間動態平衡遭受破壞是被公認的重要成因,當成骨細胞分化作用減弱,同時破骨細胞分化作用增強時,骨吸收超過骨生成,就會導致骨質疏松發生。骨的轉換過程能夠通過測定間接標志物,反映成骨細胞和破骨細胞的活性。血清中 OC 水平可作為評估骨轉換率及骨形成的特異性標志物,OC 則會參與成骨細胞分化及基質的礦化全過程。此外本研究還選定尿液DPD、CA、P等生化指標,代表了骨組織中無機物的變化狀態,通過以上指標全面反映骨代謝情況。本研究發現:經過12周干預S組、R組、G組和GR組血清OC、ALP、尿液DPD/Cre、Ca/Cre、P/Cre水平均明顯低于M組大鼠,而R組、G組、GR組與S組在以上指標方面差異沒有統計學意義,M組OC、ALP水平高于其他組則說明,M組大鼠骨轉換率較高,DPD/Cre、Ca/Cre、P/Cre水平高于其他組說明,骨吸收率較高,M組大鼠破骨作用增強。而進行干預的R組、G組和GR組骨代謝指標雖略高于S組但差異沒有統計學意義,說明經過跑步干預或者攝入GBE能夠調節去卵巢肥胖大鼠的骨代謝平衡,降低骨轉換率,發揮抗骨質疏松的作用。
骨密度是骨骼強度的一個重要指標,也是用來判斷骨質疏松、評價骨質健康狀況重要指標。去卵巢后18周,M組大鼠BMD、血清E2水平顯著低于S組大鼠,再結合大鼠體重變化可判斷本研究去卵巢骨質疏松肥胖大鼠模型構建成功。R組、G組GR組大鼠BMD、血清E2水平顯著高于M組,說明GBE攝入對于骨密度具有改善作用,此結果與Mokuda等[16]的研究結果相似。Pan等[17]也觀察到 GBE攝入能夠加速骨形成促進骨折愈合。GBE能夠改善骨密度的機制可能是GBE能促進RAW264.7細胞凋亡,使RANKL誘導的RAW264.7細胞的G0-G1期阻滯縮短,從而抑制破骨細胞分化、阻礙骨吸收作用。GR組骨密度高于G組和R組,并接近顯著水平。這現象說明跑步配合GBE攝入能夠效果疊加,跑步配合GBE對于骨密度的改善更為顯著,先前在Mokuda等[16]的研究中采用運動加膳食添加劑方案取得較好效果,本研究與該研究結果類似。本研究中跑步運動配合銀杏葉提取物攝入對骨密度具有明顯改善作用,在跑步運動配合銀杏葉提取物攝入中長期干預下,絕經骨質疏松肥胖模型大鼠骨密度能夠接近正常大鼠骨密度。
氧化應激(oxidative stress,OS)是指機體受到各種有害外界刺激情況下,體內氧化與抗氧化的動態平衡被打破,體內高分子活性物質過多,超過細胞氧化物的清除能力,導致中性粒細胞炎性浸潤,蛋白酶分泌增加,產生大量氧化中間產物,從而導致組織損傷。氧化應激被認為是導致機體衰老和疾病的重要因素[8]。機體內存在的酶能夠防御清除自由基如:SOD、CAT等。SOD、CAT、GSH-Px是抗氧化的重要檢測指標,而 MDA為脂質過氧化最終產物。MDA、SOD、CAT、GSH-Px 是大多數研究采用的反應氧化應激水平和抗氧化能力的指標。本研究結果顯示R組、G組和GR組MDA水平顯著低于M組,而CAT、GSH-PX、SOD水平則顯著高于M組,說明通過去卵巢肥胖骨質疏松大鼠利用跑步運動配合攝入GBE方案、單純攝入GBE方案、跑步方案進行中長期干預治療能夠增加機體抗氧化能力。過去許多學者進行運動抗氧化方面研究,已經證實中低強度有氧運動能夠提升機體抗氧化能力[18]。通過長期規律的運動,能夠提升SOD、CAT、GSH-Px活性從而增加機體抗氧化能力,已經被大量研究證實[19]。程林認為,中低強度運動能夠保持機體氧化應激,從而保持了SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶的活性[20]。大量研究均證實生物類黃酮和多酚被認為可以有效清除體內的自由基,GBE主要成分即為黃酮類化合物,此外還含有銀杏內酯、酚類。也有研究指出GBE能直接清除超氧陰離子及氧自由基,提升SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶的活性降低血清活性氧含量和黃嘌呤氧化酶活性[11]。與通過跑步運動和攝入GBE增強抗氧化能力的機制不同,兩種方法聯合使用,抗氧化效果進一步提高。
慢性代謝綜合征中高血脂癥為常見表征,高血脂是通常由于機體攝取脂肪過量或脂代謝障礙等所誘發的血漿中脂類物質濃度過高或持續升高的一種異常生理生化表現。大量流行病學研究證實,血液總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)水平與冠心病發病率顯著正相關,HDL-C水平與腦卒中、冠心病、動脈粥樣硬化疾病的發病率呈高度負相關。前文對于大鼠體重變化進行了探討,體重變化雖能夠一定程度反應脂代謝的情況,但目前對于脂代謝的常用指標為TC、TG、HDL-C、LDL-C,本研究發現經過12周干預M組大鼠血液TG、TC、LDL-C水平顯著高于S組、R組、G組、GR組,S組大鼠血液TG、TC、LDL-C水平顯著低于R組、G組,該現象表明跑步運動和攝入GBE均可降低血脂,達到改善脂代謝的目的。Hweta等[21]研究顯示中低強度跑步運動能夠顯著降低總膽固醇、甘油三脂水平。Miguel等[22]研究顯示18周有氧跑步運動能夠顯著降低LDL-C水平,提高HDL-C水平。本研究的跑步運動速度為0.7 km/h,屬于中低強度運動,正是運動控制體重和降低血脂的最佳強度。跑步運動對于降低體重和血脂具有明顯作用,這已經被大量研究證實,本研究結果也再次證實跑步對于血脂的調節作用。本研究中攝入銀杏葉提取物組TG、TC、LDL-C水平顯著低于M組,這表明GBE具有調節改善血脂的作用。先前文獻報道,GBE能夠降低高血脂大鼠血清中總膽固醇水平的作用。Chobanian等[23]認為GBE能夠調節血脂是通過清除氧自由基和抗脂質過氧化作用機制實現的降脂。本研究結果顯示GBE能夠降低大鼠CAT、MDA,提升SOD、GSH-PX,說明GBE具有清除氧自由基和抗脂質過氧化的作用。本研究顯示跑步+GBE攝入的方案,比單純跑步或攝入GBE具有明顯的調節血脂的效果,這說明跑步結合GBE攝入,能夠產生疊加效應,是更高效的調節血脂方案。目前本研究主要集中于GBE提取物研究只涉及其中的一個環節, 對于GBE調血脂的機制研究還比較少,值得進一步的研究。
去卵巢肥胖骨質疏松大鼠利用跑步運動配合GBE攝入方案或單純攝入GBE方案進行中長期干預治療能夠增加骨密度和雌激素水平,降低骨吸收和骨轉換率、降低體重和血脂水平、增加抗氧化能力。