牛膝活性成分β-蛻皮甾酮通過Akt信號干預地塞米松誘導的骨細胞凋亡

魏元基 李峻昊 王利波 王成龍 戴薇薇

上海中醫藥大學附屬龍華醫院，上海 200032

臨床上糖皮質激素(glucocorticoid, GC)被廣泛用于抗炎、抗過敏、抗中毒、抗休克的治療，但易導致骨質疏松癥的發生[1-3]。GC誘導的骨質疏松癥(glucocorticoid induced osteoporosis, GIOP)是繼發性骨質疏松癥的最常見病因。臨床流行病學研究顯示，在美國約50%風濕性關節炎患者長期使用GC，治療數周后，骨量開始流失，最初數月內的骨量丟失迅速，達5%～15%。長期接受GC治療(半年以上)的患者骨質疏松發生率高達30%～50%[3]。

β-蛻皮甾酮(β-Ecdysone，β-Ecd)為牛膝根內主要活性成分之一。本研究發現，β-Ecd有助于改善去勢小鼠的脊椎骨小梁體積與骨強度，一定劑量的β-Ecd可以提高成骨細胞的活性而抑制破骨細胞的活性[4]。骨細胞在骨組織中占90%～95%，形成遍布骨基質的三維骨細胞網絡(osteocyte network)。其被認為是機械應力感受細胞及活躍的旁分泌細胞。但近年研究表明，骨細胞可能是骨重塑的調節中心，起著包括骨重塑的啟動、骨吸收的抑制以及骨形成調節等的重要作用[5]。本實驗研究β-Ecd對Dex誘導的骨細胞凋亡的干預作用，并檢測Akt1、P-Akt(Thr308)、CX43、Caspase9、Bad、P-Bad蛋白的表達，以探討β-Ecd作用于骨細胞可能的分子途徑。為β-Ecd干預GIOP的作用機制提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 藥物和試劑

β-蛻皮甾酮(批號：10020231，規格: 99%，分子量: 480.6，上海同田生物技術有限公司)，地塞米松(批號：D9184，分子量: 434.5，Sigma公司)，α-MEM 培養基(Hyclone公司)，胎牛血清(Hyclone 公司)，青鏈霉素(Hyclone公司)，PI3K抑制劑LY294002(LY，編號：9901S，Cell Signaling Technology 公司)，Annexin V- FITC/PI(編號：V13241，Thermo fisher公司)，BCA蛋白濃度檢測試劑盒(編號：P0010，碧云天公司)，Akt1、P-Akt-T308、CX43、Caspase9、Bad、P-Bad、GAPDH 單克隆兔抗小鼠抗體(Cell Signaling Technology公司)，羊抗兔 IgG-HRP 二抗(Santa Cruz公司)，ECL顯色試劑盒(批號：P0 018 A，上海碧云天生物技術有限公司)。

1.2 儀器

CO2培養箱(型號：FORMA STERI-CYCLE i160，Thermo Scientific公司)，生物安全柜(型號：MSC 1.8，Thermo Scientific公司)，電泳儀與凝膠垂直電泳系統(型號：Mini Protean，美國 BIO-RAD 公司)，酶標儀(型號：Synergy2，Bio Tek公司)，流式細胞儀(型號：C6，BD 公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1MLO-Y4骨樣細胞給藥與分組：MLO-Y4骨樣細胞以α-MEM培養基(2.5% 胎牛血清+2.5% 小牛血清+1%青鏈霉素)于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。當細胞密度達到80%～90%時，分別以Dex、LY(PI3K抑制劑)、不同濃度的β-Ecd進行干預，將細胞分為6組：①正常組；② 10 μmol/L Dex模型組；③ 10 μmol/L Dex+10 μmol/L β-Ecd組；④ 10 μmol/L Dex+10 μmol/L β-Ecd+50 μmol/L LY294002組；⑤10 μmol/L Dex+0.1 μmol/L β-Ecd組；⑥ 10 μmol/L Dex+0.1 μmol/L β-Ecd+50 μmol/L LY294002組。作用時間為48 h。

1.3.2Annexin V- FITC/PI 法檢測凋亡：MLO-Y4骨樣細胞用0.25%胰酶消化，洗滌，1300g，4 ℃離心5 min，收集。加入 5 μL FITC 標記的 Annexin- V 室溫避光15 min，再加入PI，避光反應5 min 后，加入5 μL緩沖液(binding buffer)，進行流式細胞凋亡檢測(N=3)。

1.3.3Western-Blot檢測Dex、β-Ecd作用下Akt、P-Akt(Thr308)、CX43、Caspase9、Bad、P-Bad、GAPDH蛋白表達：提取各組細胞總蛋白，以BCA法進行蛋白定量測定，變性蛋白，SDS-PAGE 電泳，轉膜，封閉，分別加入稀釋后的一抗(Akt1、P-Akt(Thr308)、CX43、Caspase9、Bad、P-Bad稀釋比例 為1∶200，GAPDH稀釋比例為1∶400)，置于4 ℃冰箱過夜，PBST 洗滌8次，每次5 min；將PVDF膜放入含辣根過氧化物酶標記的稀釋二抗(HRP Goat anti-Rabbit IgG，對磷酸化一抗稀釋比例為1∶3000，對其余一抗稀釋比例為1∶15000)，室溫孵育1 h，PBST洗滌8次，每次5 min。ECL 試劑顯色，凝膠圖像分析儀曝光、拍照。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 流式細胞儀Annexin V- FITC/PI 法檢測各組細胞凋亡

流式細胞儀檢測細胞凋亡結果(圖1)顯示：與正常組比較，造模組(10 μmol/L Dex)凋亡率升高；與造模組比較，用藥組(10 μmol/L β-Ecd，0.1 μmol/L β-Ecd)降低了凋亡率；而加入抑制劑LY(第4、6組)凋亡率明顯升高。同時發現，第4組(10 μmol/L β-Ecd)凋亡率比第6組(0.1 μmol/L β-Ecd)低。

圖1 流式細胞儀檢測凋亡結果Fig.1 Apoptosis results detected with flow cytometry

圖2 MLO-Y4細胞凋亡率與正常組比較， *P<0.05；與造模組比較，△△ P<0.01。Fig.2 Apoptosis rate of MLO-Y4 cells

2.2 Western-Blot檢測各組細胞相關基因蛋白表達

與正常組比較，Dex組Akt1、CX43蛋白表達降低；與造模組(10 μmol/L Dex)比較，β-Ecd(10 μmol/L，0.1 μmol/L)使Akt1、CX43蛋白表達增強；

與給藥干預組比較，加入LY后，Akt1、P-Akt(Thr308)、CX43蛋白表達均降低。

表1 各組細胞相關蛋白表達結果Table 1 The results of cell-associated protein expressions in each

注：與正常組比較*P<0.05；與造模組比較△P<0.05。

Caspase9、Bad是促進凋亡的因子，Bad磷酸化(P-Bad)則抑制Bad活性。與正常組比較，Dex組Caspase9、Bad表達增強、P-Bad表達減弱，提示誘發凋亡；與造模組(10 μmol/L Dex)比較，β-Ecd(10 μmol/L，0.1 μmol/L)減弱Caspase9的表達；加入抑制劑LY組(第4、6組)，Caspase9、Bad表達明顯減弱、P-Bad表達明顯升高，且第4組、第6組表達因β-Ecd濃度不同而有差異。

圖3 Western-Blot檢測結果Fig.3 Results of Western-Blot

3 討論

GC廣泛應用于臨床，但同時也伴隨不良反應，如導致骨質疏松的發生。目前認為，骨形成的抑制和骨細胞的凋亡在糖皮質激素誘導的骨質疏松癥的發病機制中起到一定且關鍵的作用，而在GC使用期間骨吸收的變化是可變的[6]。過量的GC抑制Akt蛋白的活性，從而抑制了骨形成[7]；高劑量或者長時間使用GC則影響骨的水化、骨內血管及骨的強度而導致骨細胞的凋亡[8]，約25%的患者由于凋亡的細胞的聚集而發生骨壞死，從而增加股骨頭塌陷的風險[9]。本研究結果發現，高濃度(10 μmol/L)Dex使MLO-Y4骨細胞凋亡率升高。

有學者發現，衰老會導致骨細胞凋亡增加[10]。牛膝活性成分β-蛻皮甾酮具有明顯的延長果蠅壽命、降低MDA(malonaldehyde，丙二醛)、升高SOD(superoxide dismutase，超氧化物歧化酶)活性等抗衰老作用[11]。

CX43(骨連接蛋白)是骨細胞中表達最豐富的半通道蛋白，由兩個并列連接子或半通道形成的間隙連接調節骨細胞、成骨細胞和破骨細胞之間的細胞間通訊，因此在骨形成和骨重塑中發揮關鍵作用[12]。有實驗發現，Dex可誘導CX43降解，而Akt磷酸化則抑制CX43降解，CX43降解可能導致骨質流失[13]。PI3K/Akt信號通路在調節細胞增殖、生長和凋亡中起重要作用，本研究結果表明，10 μmol/L地塞米松使MLO-Y4骨細胞Akt1、CX43蛋白表達降低，而β-Ecd使Akt1、CX43蛋白表達升高。LY294002是PI3K/Akt信號通路特異性抑制劑，體外和體內實驗表明LY通過抑制Akt磷酸化而抑制Akt蛋白活性并增加凋亡率[14]。研究發現，β-Ecd并不能使LY降低的Akt1蛋白表達升高。由此反證β-Ecd在骨細胞中可能通過Akt途徑對Dex誘導的凋亡起干預作用。

據報道線粒體是調節細胞凋亡的關鍵。激活Bad使線粒體通透性提高，細胞色素C從膜間隙釋放到細胞質中，最終激活Caspase酶介導的凋亡程序。而P-Bad與分子伴侶蛋白14-3-3結合，能抑制Bad的表達[15-16]。研究發現，10 μmol/L Dex抑制骨細胞Bad蛋白的磷酸化，促進Bad、caspase9蛋白的表達，而一定濃度的β-Ecd干預則使Caspase9蛋白的表達降低。表明β-Ecd 可能通過線粒體凋亡途徑抑制Dex誘導的骨細胞凋亡。

綜上，牛膝活性成分β-蛻皮甾酮通過激活骨細胞中的PI3K/Akt信號通路，從而干預Dex誘導的骨細胞凋亡，該過程可能依賴于線粒體凋亡途徑。