IM患兒外周血單核細胞TLR2、TLR9及CD19+、CD23+表達水平及意義

孫 丹,李艷艷,田秀穎,錢 同

(徐州市兒童醫(yī)院檢驗科,江蘇徐州 221000)

傳染性單核細胞增多癥(IM)是發(fā)生在EBV感染之后常見的表現(xiàn)形式，作為兒童時期常見的感染性疾病之一，近年來發(fā)病率逐漸在增加[1]。有研究指出B細胞是EBV感染的最初靶細胞，在淋巴細胞中CD19+為B細胞，而CD19+和CD23+同時為陽性即為永生B細胞，在EBV侵入機體后，Toll樣受體(TLRS)參與了該病毒病原體的識別，同時在EBV的感染及轉(zhuǎn)歸中起到了重要的作用，TLR2和TLR9是該受體的重要組成成分[2]。本研究將通過觀察IM患者外周血某些指標(biāo)在不同時期內(nèi)的變化并對其在IM發(fā)病過程中的作用進行探究。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1月至2018年1月本院兒科初治的IM患兒40例作為研究對象，40例IM患兒根據(jù)IM治療過程分期分為急性期組(初始發(fā)病至1周時間內(nèi))和恢復(fù)期組(初始發(fā)病期進行治療后第25～30天)[3]，年齡2～13歲，平均(6.93±3.72)歲，其中男21例，女19例；納入標(biāo)準(zhǔn)：符合IM診斷的標(biāo)準(zhǔn)且均為初次發(fā)病且均無糖皮質(zhì)激素類藥物或細胞毒性藥物使用史。另選取同期在本院兒童保健門診進行常規(guī)體檢的40例健康兒童作為對照組，年齡2～12歲，平均(7.09±4.11)歲，其中男22例，女18例；對照組均無發(fā)生變態(tài)反應(yīng)性疾病史和其他免疫性的疾病，各組在性別和年齡上比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。參與本次研究的患兒均簽署了知情同意書，且本研究均經(jīng)過了本院倫理學(xué)會討論通過。

1.2樣本采集處理 分別采集各組靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，樣本采集當(dāng)天后進行B細胞流式細胞分析，分離的血漿進行TLR2和TLR9熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)分析。

1.3指標(biāo)測定 采用CD19+和CD19+CD23+由美國BD公司提供的BD FACSCantoTM流式細胞儀器進行測定。相應(yīng)的配套試劑也由該公司提供。TLR2和TLR9的mRNA測定采用美國 ABI 公司7900 hT Fast Real-Time PCR System 型實時熒光定量 PCR儀器進行測定；其中引物由上海生物工程技術(shù)公司提供。Trizol 試劑盒購自美國 Invitrogen 公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國 ABI公司，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒購于大連寶生物工程有限公司；根據(jù)參考基因進行相對定量的ΔCt法計算目的基因相對表達量的計算。

2 結(jié) 果

2.1各組CD19+和CD19+CD23+表達情況 通過研究發(fā)現(xiàn)，急性期組的CD19+和CD19+CD23+陽性表達率顯著低于恢復(fù)期組和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);恢復(fù)期組的CD19+和CD19+CD23+陽性表達率顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組CD19+和CD19+CD23+陽性表達率(%，±s)

注：與急性期組比較，#P<0.05；與恢復(fù)期組比較，*P<0.05

2.2各組TLR2mRNA和TLR9mRNA表達水平情況 急性期組TLR2mRNA和TLR9mRNA表達水平顯著高于恢復(fù)期組和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);恢復(fù)期組的TLR2mRNA和TLR9mRNA表達水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組TLR2mRNA和TLR9mRNA表達水平±s)

注：與急性期組比較，#P<0.05；與恢復(fù)期組比較，*P<0.05

3 討 論

IM是由EBV感染所致。有研究指出淋巴B細胞的表面存在EBV的特異性受體，所以淋巴B細胞也成了該病毒持續(xù)感染的終身潛伏場所。在EBV細胞感染B細胞后可以逃避免疫的監(jiān)視過程，為建立持續(xù)性感染的B細胞庫提供了機會，在細胞免疫功能低下的時候，造成了永生B細胞不斷地繁殖[4-5]。CD19+分子是B細胞表面的糖基化的跨膜蛋白，是B細胞表面的特異性蛋白，該蛋白水平直接代表了B細胞的水平。CD23+是主要在活化的B細胞表面表達的跨膜蛋白，可以作為B細胞活化的重要標(biāo)志物，當(dāng)CD19+分子和CD23+同時陽性時代表永生B細胞[6-7]。對于CD19+和CD23+兩個分子水平的測定，是對IM患兒外周血B細胞和永生B細胞水平的較好的反應(yīng)[8]。在B細胞活化的過程中與B細胞表面的抗體是密不可分的，其中Toll樣受體提供了B細胞活化的途徑。最主要的兩種是TLR2和TLR9。TLR2能夠較多地識別配體，在EBV感染時是參與到免疫應(yīng)答的直接受體，能夠直接地刺激B細胞激活，在EBV感染的時候能夠刺激炎癥因子的產(chǎn)生繼發(fā)相應(yīng)的病理反應(yīng)[9-10]。 TLR9能夠被EBV病毒的DNA基序所激活，能夠促進B細胞的激活，促進其增殖和活化，活化后的TLR9又能反過來上調(diào)TLR9。在動物實驗中已經(jīng)有證實，在抗病毒的免疫應(yīng)答中TLR9具有積極的作用[11]。

在本研究中發(fā)現(xiàn)，在急性期組的CD19+和CD19+CD23+的陽性表達率明顯低于恢復(fù)期，在感染的急性期，病毒入侵B細胞，在細胞表面的受體就會對抗原進行識別和提呈給免疫細胞，引起體內(nèi)的免疫反應(yīng)，進而對感染了EBV病毒的B細胞進行殺滅[11]。所以體內(nèi)CD19+和CD19+CD23+陽性表達率就會下降，相對而言，急性期的下降幅度和數(shù)量要顯著高于恢復(fù)期的患兒。而處于恢復(fù)期的患兒上述指標(biāo)表達水平也要低于對照組。同時本研究還發(fā)現(xiàn)，急性期組的TLR2mRNA和 TLR9mRNA水平要顯著高于對照組，且急性期組的二者要顯著高于恢復(fù)期組，Toll樣受體作為一種跨膜的信號傳遞受體，在識別入侵性的病原微生物中發(fā)揮著重要的作用[12-13]。在 IM 的急性期，TLR2 通過機體的固有免疫反應(yīng)，限制 EB 病毒的傳播和表達，TLR9 識別 EBV且限制其傳播并控制已被病毒感染的潛伏 B 細胞而發(fā)揮作用[14]。在病原體侵入機體后，機體通過上調(diào)TLR2mRNA和 TLR9mRNA來更全面地識別和更迅速地提呈給免疫細胞，進行機體免疫反應(yīng)[15]。在疾病處于恢復(fù)期時，TLR2與TLR9的配體對TLR2與TLR9的刺激作用減少，從而二者的mRNA表達下調(diào)。

4 結(jié) 論

IM患兒的外周血單核細胞TLR2、TLR9及CD19+、CD23+各分子指標(biāo)在IM的患者的不同時期表達水平不同，這些指標(biāo)可能參與了IM的發(fā)生和轉(zhuǎn)歸的全過程。