Wnt2、Dv-lmRNA及蛋白表達情況與食管癌細胞浸潤轉移的相關性分析

邵鐵良，邵一峰,馬平均

(1.平頂山市第一人民醫院 胸外科，河南 平頂山467000；2.新鄉醫學院2015級基礎臨床10班)

食管癌極易出現轉移，但血行轉移比較少見,常見轉移部位有胃、肝、肺、腎、胸膜、腹膜、腎上腺及胰腺等,以肝、肺較為常見。此外，食管癌轉移還多見內壁的直接擴散、浸潤及淋巴結轉移[1]。Wnt2作為Wnt信號轉導通路的重要啟動因子，可通過Wnt信號通路介導腫瘤的發生、發展、侵襲轉移和預后[2]。Dv-1位于β-catenin上游，屬于Wnt信號通路的正向調節因子，其在基因到蛋白的多層次研究資料較少[3]。因此，本文對Wnt2、Dv-lmRNA及蛋白表達情況與食管癌細胞浸潤轉移的相關性進行研究并探討其在臨床上應用的意義，旨在為食管癌轉移的預防提供數據參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年2月—2016年2月我院確診的食管癌患者手術切除標本100例(病灶組)，癌旁組織標本50例(癌旁組)。 病灶組男性57例，女性43例，年齡35-77歲，平均年齡50.26±10.42歲；臨床TNM分期Ⅰ期25例，Ⅱ期24例，III期51例；高分化30例，中分化35例，低分化35例；無淋巴結轉移51例，有淋巴結轉移49例；浸潤侵及漿膜55例，未侵及漿膜45例。癌旁組男性24例，女性26例，年齡33-76歲，平均年齡49.22±11.19歲。兩組標本患者的年齡、性別比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

1.1.1納入標準[5](1)術前未合并其他部位疾病； (2)術后病理證實為食管癌；(3)手術方法均為食管癌根治性手術；(4)有完整規范的術后病理報告及隨訪資料。

1.1.2排除標準 (1)合并其他系統嚴重疾病者。(2)未能完成隨訪者。(3)凝血功能障礙。(4)因其他部位腫瘤進行過放化療治療者。

1.2 檢測方法[6]

采用RT-PCR法檢測組織中Wnt2、Dv-lmRNA的水平：TRIzol法提取總RNA，具體操作按照試劑盒說明書(購于南京建成生物研究所)進行；以GAPDH為內參后cDNA為模板擴增，Wnt2 正向引物 5′-C CTTTGTTTA TGC CATCTCCTCA G-3′，反向引物 5 ′-G CG G TTGTC CA GTCA G C G TTCTT-3 ，擴增片段長度751 bp ；Dv-l正向引物 5′-CCTGTCA TCTG TCCC ACCTG-3，反向引物 5′-GTC CA G CCCTCTCTCG TCTT-3 ′，擴增片段長度為 119 bp ；Wnt2、Dv-l擴增條件為5 min 95℃，30 s 95℃，30 s，60℃，30 s 72℃，35個循環。GAPDH以30 s 59℃退火，取5 μl擴增物瓊脂糖(2%)凝膠電泳40 min，目的基因mRNA表達量為目的基因積分光密度值/GADPH積分光密度值。

采用免疫組化法檢測組織中Wnt2、Dv-l 蛋白的表達水平：分別取食管癌患者手術切除的標本和癌旁組織標本，甲醛(10%)固定，石蠟包埋后4 μm連續切片，采用SP免疫組化染色法，DAB顯色，試劑盒購于南京建成生物研究所(批次20164327，產品編號PW017)，實驗操作嚴格按試劑盒說明書進行，PBS(0.01mol/L)代替一抗陰性對照，GLUT1兔抗人抗體為陽性對照。

再利用蛋白質印跡法檢測Wnt2、Dv-l 蛋白表達情況：提取總蛋白后BCA法檢測濃度，電泳分離后濕轉法蛋白轉至PVDF膜上，脫脂奶粉(5%)2 h封閉，孵育(4℃)一抗過夜，洗滌后二抗孵育，ECL發光試劑曝光顯影。

1.3 結果判定標準[7]

1.3.1免疫組化判定標準 陰性對照用PBS代替一抗進行染色，結果做為陰性；陽性對照以各抗體說明書所提供組織進行染色，Wnt2、Dv-l表達陽性細胞有淡黃色或棕黃色著色，均主要表達在細胞質及細胞膜。每例標本在400倍光鏡下隨意選取10個視野，計數每個視野100個細胞中陽性染色的細胞數，取其平均值計算陽性百分率。采取二次計分法：先將染色按強度計分：0分無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。再將陽性細胞百分比計分，0分陽性細胞為<25%，1分為25%-50%，2分為51%-75%，3分為≥75%。用染色強度得分與細胞數得分之和作為判斷表達的結果，0分為陰性(-)，1-2分為弱陽性(+)，3-4分為中等陽性(+ +)，5-6分為強陽性(+ + +)。所有病理切片均由高年資病理醫師盲法評定結果。

1.3.2RT-PCR、蛋白質印跡判定標準 分別以每例標本Wnt2、Dv-l 與GAPDHCt值之比，作為該例標本目的基因mRNA的相對表達量；蛋白質印跡曝光結果以膠片上出現Wnt2、Dv-l 和GAPDH內參條帶，且GAPDH內參基因的曝光條帶在病灶組和癌旁組灰度一樣。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 兩組組織標本中Wnt2、Dv-l 蛋白的表達情況

Wnt2蛋白在病灶組的表達明顯高于癌旁組(P<0.05)；Dv-l 蛋白在病灶組的表達明顯高于癌旁組(P<0.05)，見表1。

2.2 兩組組織標本中Wnt2、Dv-l mRNA及蛋白的表達水平比較

病灶組Wnt2、Dv-l mRNA及蛋白含量明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)見表2；western blot結果見圖1。

表1 兩組組織標本中Wnt2蛋白表達情況 n(例)

圖1 Wnt2、Dv-l蛋白表達水平

2.3 組織標本中的Wnt2、Dv-l蛋白表達與患者臨床病理學特征的關系

Wnt2、Dv-l 蛋白表達和相對含量在不同性別、年齡、組織學分級間比較，均無顯著性差異(P>0.05)；Wnt2、Dv-l 蛋白的表達與患者腫瘤的臨床病理學分期、浸潤程度、淋巴結轉移情況有顯著性差異(P<0．05)，見表3。

表2 兩組標本中Wnt2、Dv-l mRNA及蛋白相對含量比較

表3 Wnt2蛋白表達與臨床病理因素的關系

3 討論

食管癌是常見的消化道腫瘤，全世界每年約有30萬人死于食管癌。其發病率和死亡率各國差異很大。我國是世界上食管癌高發地區之一，每年平均病死約15萬人。男多于女，發病年齡多在40歲以上[8]。食管癌典型的癥狀為進行性咽下困難，先是難咽干的食物，繼而是半流質食物，最后水和唾液也不能咽下，嚴重降低了患者生活質量。因而，食管癌的早期診斷并及時給予恰當的治療顯得尤為重要。

隨著抑癌基因和癌基因的發現和研究，細胞信號通路逐漸被闡明，人類對細胞癌變的機制了解也逐漸得到了豐富，近年來的多項研究[9,10]均證明Wnt信號轉導通路調節并控制著諸多生理過程，參與細胞的增殖、凋亡與抗凋亡等過程。Wnt途徑是調節細胞生長和發育的重要途徑，此外，該途徑與細胞癌變的關系也較為密切，上述變化可能與通路中任何成分出現改變或Wnt基因本身存在的變化而引發[11]。Dv-1蛋白在宮頸鱗癌、乳腺癌、肺癌等腫瘤中存在異常表達，研究[13]發現Wnt2單克隆抗體可下調惡性黑色素瘤細胞誘導細胞凋亡，使 Dv-1蛋白失活，進而抑制黑色素瘤體外移植瘤的生長。資料[13]顯示Wnt途徑的異常激活主要可分為以下3類：(1)過多的Wnt信號異常活躍整個途徑導致細胞出現不必要的增殖，促進Dv-1蛋白的表達；(2)組成Wnt途徑的蛋白、基因或轉錄因子出現變異或被破壞導致局部Wnt途徑或整個途徑活躍異常，進而使Dv-1蛋白出現異常表達；(3)細胞內多因素通過Wnt途徑誘發或刺激機體和細胞出現異常反應。

本研究結果顯示Wnt2、Dv-lmRNA及蛋白在病灶組中表達水平明顯高于癌旁組(P<0．05)；病灶組Wnt2、Dv-lmRNA及蛋白含量明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。上述結果說明Wnt2、Dv-l可參與食管癌的發生、發展過程。研究顯示Wnt信號通路廣泛存在于無脊椎動物和脊椎動物中，是一類在物種進化過程中高度保守的信號通路。Wnt信號在動物胚胎的早期發育、器官形成、組織再生和其它生理過程中，具有至關重要的作用,如果這條信號通路中的關鍵蛋白發生突變，導致信號異常活化，就可能誘導癌癥的發生[14]。

本研究發現Wnt2、Dv-l 蛋白的表達與患者腫瘤的組織學分化程度、臨床病理學分期及淋巴結轉移情況有密切的聯系(P<0．05)。上述結果說明，Wnt2、Dv-l 蛋白表達與食管癌細胞浸潤轉移具有密切的關聯。在食管癌的浸潤過程中Wnt2、Dv-l 蛋白的異常表達可導致食管黏膜上皮細胞的分化、增殖和凋亡出現異常，即表現出異常分化、過度增殖和凋亡減少且侵襲能力提升，進而誘發食管癌向深層和遠處進一步轉移[15]。因而，我們可認為Wnt2、Dv-l 蛋白表達異常可提示腫瘤細胞的吸收和利用增加有關，其可與食管黏膜上皮細胞的異常增殖相互促進，對食管癌的轉移和侵入發揮重要作用。

綜上所述，Wnt2、Dv-lmRNA及蛋白表達與食管癌細胞浸潤轉移具有密切的關聯。