白血病患者ID4、WT1、GLIPR1基因啟動子區異常甲基化及mRNA表達的研究

崔桂榮,李 焱,賈振薇，張金華

(邯鄲市第一醫院 血液內科,河北 邯鄲056002)

DNA甲基化(methylation)作為最早發現的修飾途徑一直屬于生命科學的前沿課題之一，其能引起染色質結構、DNA構象、DNA穩定性及DNA與蛋白質相互作用方式的改變，從而控制基因表達[1]。研究顯示[2]：白血病抑癌基因啟動子異常甲基化與白血病的發病機制密切相關，抑癌基因啟動子高甲基化抑制相關mRNA的表達水平可能為白血病發病的重要分子機制。本研究采用甲基化特異性PCR(MS-PCR)及實時熒光定量RT-PCR(RT-QPCR)對ID4、WT1、GLIPR1抑癌基因啟動子區甲基化狀態及相關mRNA進行了檢測，旨在探討白血病分子發病機制，為白血病防治提供臨床資料。

1 對象與方法

1.1 對象

選擇2016年1月至2018年1月我院血液科就診的80例初診未治白血病患者為研究對象，其中男56例，女24例，年齡15-48歲，平均(34.3±11.6)歲，包括：急性髓系白血病(AML)34例、急性淋巴細胞白血病(ALL)25例、慢性粒細胞白血病(CML)21例，白血病診斷及分型符合FAB診斷及標準；選取同期60例志愿者為對照組，男41例，女19例，年齡15-45歲，平均(33.3±10.7)歲，包括缺鐵性貧血48例，特發性血小板減少性紫癜12例。兩組在性別、年齡構成上無統計學差異(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理會批準通過，研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

兩組研究對象肝素抗凝取骨髓液2 ml，分離單個核細胞-80℃凍存行基因組提取。MS-PCR檢測ID4、WT1、GLIPR1抑癌基因啟動子區狀態，DNA/RNA抽提試劑盒購自日本Ta Ka Ra公司產品；PCR引物由Invitrogen公司合成。反應條件,ID4：94℃ 4 min；94℃ 30 s、45℃30 s、72℃45 s、30個循環；72℃延伸7 min；WTl ：94℃ 4 min；94℃ 45 s、58℃30 s、72℃45 s、40個循環；72℃延伸7 min；GLIPRI：94℃ 5 min；94℃ 30 s、45℃30 s、72℃45 s、30個循環；72℃延伸7 min。甲基化特異性引物：ID4-MF：5′-TTTTATAAATATAGTTGCGCGGC-3′；ID4-MR：5′-GAATATCCTAATCACTCCCTTCGA-3′；WTl-MF：5′-TTTGGGTTAAGTT-

AGGCGTCGTCG-3′：WTl-MR：5′-ACACTACTCCTCGTACGACTCCG-3′；GLIPRl-MF：5′-TAAT-

TATATTTTTAGAAATTGCGGC-3′：GLIPRl-MR：

5′-ACTATTAATTTCACCTCTAATCGAA-3′。

RT-PCR檢測相關mRNA表達情況，人急性髓系細胞白血病細胞株HL-60及慢性粒細胞白血病細胞株K562購自珠江醫院，RT逆轉錄試劑盒購自寶生物工程有限公司。ID4：上游引物：5′-TCACTGCGCTCA ACACCGACCC-3′；下游引物：5′-TTCCCCCT CCCTCTCTAGTGCTCCTG-3′；WTl：上游引物：5′-GATAACCACACA ACGCCCATC-3′；下游引物：5′-CACACGTCGCACATCCTG AAT-3′；GLIPRI：上游引物：5′-AATAGCCTGGATGGTTTCTT-3′，下游引物：5′-CATAGTCCTGGATTTCGTCA-3′。

反應條件，ID4：94℃ 4 min；94℃ 30 s、60℃30 s、72℃45 s、40個循環；72℃延伸7 min；WTl ：94℃ 4 min；94℃ 45 s、55℃45 s、72℃45 s、30個循環；72℃延伸7 min；GLIPRI：94℃ 5 min；94℃ 30 s、49℃30 s、72℃45 s、30個循環；72℃延伸8 min。

1.3 統計學處理

數據分析采用統計學軟件SPSS19.0，白血病患者與對照組構成比、率的比較采用卡方檢驗，mRNA表達以2-▲Ct表示，均值比較采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK法分析，以P<0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 白血病患者與對照組ID4、WT1、GLIPR1基因啟動子區甲基化比較

白血病患者與對照組ID4、WT1、GLIPR1基因啟動子區甲基化經卡方檢驗分析比較均有統計學差異(P<0.05)，與對照組比較白血病患者WT1甲基化程度降低，ID4及GLIPR1基因啟動子區甲基化程度增高；AML、ALL及CML患者ID4、WT1、GLIPR1基因啟動子區甲基化經卡方檢驗分析比較均無統計學差異(P>0.05)。

2.2 白血病患者與對照組ID4、WT1、GLIPR1基因mRNA表達比較

白血病患者與對照組ID4、WT1、GLIPR1基因mRNA表達比較經方差分析均有統計學差異(P<0.05)，組間兩兩比較經SNK法分析，ID4基因mRNA表達，AML、ALL及CML組間無統計學差異(P>0.05)，均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；WT1、GLIPR1基因mRNA表達四組比較，任意組間均有統計學差異(P<0.05)。

表1 白血病患者與對照組ID4、WT1、GLIPR1基因啟動子區甲基化比較(n，%)

注：與對照組比較*P<0.05，與AML比較#P<0.05，與ALL比較▲P<0.05

表2 白血病患者與對照組ID4、WT1、GLIPR1基因mRNA表達比較(n，%)

注：與對照組比較*P<0.05，與AML比較#P<0.05，與ALL比較▲P<0.05

3 討論

白血病的分子發病機制一直為血液病研究的熱點，諸如DNA甲基化等表觀遺傳也是當今生命科學研究的前沿領域[3]。作為DNA的天然修飾方式，DNA甲基化為DNA甲基轉移酶催化甲基供體將胞嘧啶轉變為5甲基胞嘧啶的過程，其參與基因的表達、調控，細胞分化、增生與調節。研究顯示[4-6]：異常甲基化與腫瘤的發生密切相關。其中常見的異常甲基化包括抑癌基因啟動子CPG島的異常超甲基化以及DNA廣泛的低甲基化。部分學者認為[7,8]：異常甲基化影響基因的表達，可能為白血病發病的重要分子機制。而白血病抑癌基因甲基化譜的研究也為白血病的個性化防治提供了一個全新的思路。本研究著重于探討ID4、WT1、GLIPR1抑癌基因啟動子區甲基化狀態及相關mRNA的表達特點，旨在研究白血病分子發病機制，為白血病防治提供臨床資料。

本研究數據顯示：AML、ALL及CML甲基化程度均高于對照組，ID4基因mRNA表達也有別于對照組，差異具有統計學意義。動物實驗顯示[9]：ID4基因為白血病的抑癌基因，定位于人類染色體6p21.3～22，基因所表達的Id蛋白具有高度保守性HLH結構域，為相關基因轉錄的正性調節轉錄因子，當ID4基因甲基化程度降低時，Id蛋白可與HLH結構域形成同源二聚體，在轉錄調控的作用也逆轉為負性作用。研究發現[10]：ID4基因與腫瘤血管形成及腫瘤的侵襲有關；在白血病患者中多呈現高度的甲基化[11]。WT1基因最初分離于Wilms瘤細胞，為參與轉錄的雙相調節子，可阻止細胞G0及G1期轉入S期，為腫瘤抑制基因。在造血系中可調控造血細胞增殖、分化，參與造血的調控。本研究中AML、ALL及CML患者WT1基因啟動子區均呈現低甲基化，相應WT1基因mRNA呈現強表達，WT1基因啟動子區甲基化程度與相應mRNA成反比。WT1基因在一定程度上可認為是“泛白血病”基因標志[12]。國外有研究顯示[13]：AML、ALL及CML患者WT1基因mRNA表達與病情的進展相關，病情嚴重患者WT1基因mRNA多呈現強表達；WT1基因mRNA表達臨床可應用于AML、ALL及CML病情的監測。GLIPRl基因源于膠質細胞克隆基因，為髓系單核細胞分化標志物，GLIPRl基因啟動子區甲基化程度可負性調控相關mRNA的表達，在AML患者GLIPRl基因啟動子區甲基化程度最高，高甲基化可導致相關基因的沉默及缺失；在研究中AML患者GLIPRl基因mRNA表達程度最低，有學者認為GLIPRl基因為AML患者甲基化的沉默基因[14]。同時甲基化狀態與AML微小殘留病密切相關，這為髓系白血病的治療提供了一個新的方向。抑癌基因甲基化狀態的改變以及由此引發的相關mRNA表達異常與白血病的發生、發展關系密切。

綜上所述，血液系統惡性腫瘤的發生為一多因素參與的過程，其中抑癌基因甲基化狀態的改變及相關mRNA表達異常與之密切相關，腫瘤表觀遺傳學為血液系統惡性腫瘤的防治提供一個新的方向。