槲皮素對糖尿病大鼠腎臟足細胞nephrin和podocin表達的影響

靳英麗,屈智慧,楊盼盼,袁渤雨,陳麗波

(1.吉林大學基礎醫學院，吉林 長春130021； 2.吉林大學第一醫院；3.吉林大學中日聯誼醫院)

糖尿病腎病(DN)為糖尿病最常見、最嚴重的微血管并發癥之一，是引起終末期腎病的重要原因。DN的特征性標志是蛋白尿，足細胞參與構成腎小球的濾過屏障，其損傷導致早期DN蛋白尿的發生，是DN發病與進展的中心靶點[1]。Nephrin、podocin是構成足細胞裂孔隔膜的關鍵蛋白，其中nephrin特異性地在腎小球足細胞中表達。基因突變或高糖等應激條件造成的nephrin表達減少可導致裂孔隔膜破壞和蛋白尿，因此，nephrin可作為腎小球足細胞損傷的重要標志[2]。Podocin是一種支架蛋白，對維持足細胞裂孔隔膜結構和功能的完整性起重要作用。Podocin突變或表達減少，可出現早期蛋白尿、足突融合、裂孔隔膜消失等腎臟損害[3]。

槲皮素是一種多羥基黃酮類化合物，化學名為3,3’,4’,5,7-五羥基黃酮，具有多種生物學活性及很高的藥用價值。槲皮素廣泛存在于植物的花、葉、果實中。槲皮素藥理作用廣泛，具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗菌、免疫調節及心血管保護作用等[4-6]，對糖尿病并發癥如心血管疾病、視網膜病變、DN等有很好療效[7-9]，愈加受到國內外研究者的關注和重視。近年來有關槲皮素抗DN的作用機制研究主要集中在對系膜細胞及腎小管上皮細胞的作用上。故本實驗以糖尿病大鼠為研究對象，研究槲皮素對糖尿病大鼠腎臟功能及腎皮質足細胞裂孔膜蛋白nephrin及podocin表達的影響，探討槲皮素的抗DN作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1材料動物選取SPF級雄性Wistar大鼠，體質量200-250 g，購自吉林大學實驗動物中心(合格證號：SYXK(吉)2007-0011)。試劑：鏈脲佐菌素(STZ)規格：100 mg /支(美國Sigma-Aldrich公司)，槲皮素(10 g/支，美國Sigma-Aldrich公司)，anti-nephrin、anti-podocin、anti-β-actin、 IgG二抗(美國Abcam公司)。主要儀器：微量血糖測定儀(Free Style，美國雅培公司)，全自動生化分析儀(美國Beckman公司)，高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)，電泳儀及蛋白轉膜儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2實驗動物分組及模型制備雄性Wistar大鼠禁食不禁水12 h，單次腹腔注射STZ 55 mg/kg(溶于0.1 mmol/L枸櫞酸緩沖液，pH 4.2)。注射STZ 后72 h尾尖采血，微量血糖測定儀檢測隨機血糖，以血糖濃度≥16.7 mmol/L確定為糖尿病模型制備成功，未達標準大鼠棄去不用。造模成功的大鼠隨機分為糖尿病模型組(Diabetic model，DM，n=8)，槲皮素給藥組(Qu,n=8，劑量100 mg/kg/d)。槲皮素給藥方式為灌胃給藥，按上述劑量每日1次，共12周；正常對照組(CON，n=8)以等體積枸櫞酸緩沖液代替STZ及槲皮素給藥。

1.3標本采集實驗結束前1 d，各組大鼠用代謝籠收集24 h尿液，留用測定24 h尿中總蛋白、白蛋白、尿素和肌酐水平。大鼠空腹8 h后稱重，乙醚麻醉后腹主動脈取血、分離血清，待測血肌酐、尿素水平。摘取腎臟，去除被膜后稱重。去除腎臟髓質，皮質放入液氮中速凍后轉移到-80℃保存。

1.4腎臟指數的計算及血、尿生化指標測定各組大鼠稱量體質量和腎臟濕重，計算腎臟肥大指數(腎重/體質量，KW/BW)。用全自動生化分析儀對采集的血液樣品進行血肌酐、尿素的檢測，對采集的尿液樣品進行尿總蛋白、白蛋白、肌酐、尿素水平檢測。

1.5Westernblot方法檢測腎皮質nephrin和podocin的蛋白表達稱取10 mg冰凍腎皮質，在100 μl冰預冷的懸浮緩沖液中將組織剪碎，加入等體積的2×SDS凝膠上樣緩沖液，混合后置于沸水浴中加熱5 min，超聲處理儀剪切。10 000×g離心10 min，取上清液進行BCA法蛋白定量，取50 μg總蛋白的組織裂解產物進行12% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。濕轉至硝酸纖維素膜后置于封閉液中，室溫封閉1-2 h，TBS漂洗膜3次，分別加anti-nephrin、anti-podocin、anti-β-actin進行一抗孵育，加辣根過氧化物酶標記的兔抗山羊二抗，放入搖床室溫搖動1 h，漂洗后ECL顯色，拍照。Western條帶用Quantity one軟件分析。結果以目的蛋白OD值與內參β-actin的OD值比值表示。

2 結果

2.1槲皮素對糖尿病大鼠腎臟指數及血中肌酐、尿素水平的影響

糖尿病模型分組給藥 12周后，檢測大鼠腎臟指數、血肌酐及尿素，結果如表1所示，與正常對照組相比，糖尿病模型組腎臟指數、血肌酐和血尿素氮水平較正常對照組明顯升高(P<0.01)，提示腎臟肥大、腎功能受損；槲皮素給藥12周后，槲皮素給藥組與糖尿病模型組相比，腎臟指數降低(P<0.05)、血肌酐和尿素明顯降低(P<0.01)。

表1 槲皮素對糖尿病大鼠腎臟指數及血肌酐、尿素水平的影響

注：與正常對照組比較*P<0.05，* *P<0.01；與糖尿病模型組比較#P<0.05，# #P<0.01。

2.2槲皮素對糖尿病大鼠24h尿中總蛋白、白蛋白、肌酐、尿素水平的影響

分組給藥12周后，檢測大鼠24 h尿總蛋白、白蛋白、尿中肌酐、尿素含量，結果如表2所示。與正常對照組相比，糖尿病模型組24 h尿總蛋白、白蛋白明顯升高(P<0.01)；尿中肌酐和尿素水平明顯降低(P<0.01)；槲皮素給藥 12周后，槲皮素給藥組與糖尿病模型組相比，24 h尿中總蛋白和白蛋白水平都明顯降低(P<0.01)，尿中肌酐和尿素水平升高(P<0.05)。

表2 槲皮素對糖尿病大鼠尿中總蛋白、白蛋白、肌酐、尿素氮水平的影響

注：與正常對照組比較*P<0.05，* *P<0.01；與糖尿病模型組比較#P<0.05，##P<0.01。

2.3槲皮素對糖尿病大鼠腎皮質足細胞nephrin和podocin蛋白表達的影響

采用Western blot方法檢測nephrin和podocin在各組大鼠腎皮質中的蛋白表達變化情況。結果顯示，糖尿病模型組足細胞標志蛋白nephrin和podocin表達明顯比正常對照組下降，槲皮素治療組腎皮質nephrin和podocin表達水平高于糖尿病模型組(圖1)。

注：CON：正常對照組，DM：糖尿病模型組，QU：槲皮素給藥組。 * *與正常對照組比較，P<0.01；#與糖尿病模型組比較，P<0.05。

3 討論

我國是全世界糖尿病發病的第一大國，約有1/3病例會發展為DN，是引起終末期腎病的重要原因。目前DN尚無特效治療藥物，故探索DN發病機制及尋找安全有效的抗DN新藥具有十分重要的意義。

已知100 多種中草藥中含有槲皮素，其廣泛存在于植物的花、葉、果實中，如槐米、槐花、丹皮、菊花、田基黃、車前子等。槲皮素藥理作用非常廣泛，包括對DN的作用。本研究中，我們給予糖尿病大鼠槲皮素灌胃12周之后進行腎臟指數及腎功能相關指標的檢測。結果表明，槲皮素給藥組的24 h尿中總蛋白和白蛋白水平都較糖尿病模型組明顯降低(P<0.01)，尿中肌酐和尿素水平升高(P<0.05)。槲皮素給藥組的腎臟指數、血肌酐和尿素較糖尿病模型組降低。結果提示槲皮素改善了糖尿病大鼠的腎功能、減輕了蛋白尿。

糖尿病腎病的病理特點包括持續加重的蛋白尿、腎臟肥大、腎小球基底膜增厚、腎小球硬化等。蛋白尿在DN的進展過程中起著關鍵作用，足細胞附著在腎小球基底膜外側，足突之間的裂孔隔膜構成腎小球濾過的最后一道屏障。足細胞損傷會導致蛋白尿的發生，進而引起腎小球硬化纖維化并最終進展為終末期腎病。在糖尿病腎病條件下，高血糖可直接損傷足細胞造成足細胞肥大、足突變寬融合、足細胞數目減少等病理現象[10]。槲皮素是如何發揮對糖尿病大鼠腎臟保護作用、減輕蛋白尿的呢？有關槲皮素抗DN作用機制的研究主要集中在藥物對系膜細胞及腎小管上皮細胞的作用上。有學者發現槲皮素通過調節TGF-β/Smad信號通路而抑制高糖下系膜細胞的增殖和細胞外基質積聚[11]，也有學者發現槲皮素通過抑制mTORC1/p70S6K信號通路減輕糖尿病腎病的腎小管上皮細胞間質化和腎纖維化[12]。

在本研究中，我們研究了槲皮素對腎小球足細胞的影響，即對足細胞裂孔膜蛋白nephrin和podocin表達的影響。結果表明，糖尿病大鼠腎臟組織中nephrin和podocin表達較正常對照組明顯降低。而槲皮素給藥后大鼠腎臟組織中nephrin和podocin表達較糖尿病模型組明顯升高。結果提示在糖尿病腎病時存在足細胞損傷，槲皮素可以在一定程度上增強裂孔膜蛋白nephrin和podocin表達。由此，我們判斷槲皮素可能通過增強nephrin和podocin的表達，從而改善DN時足細胞損傷，進而減輕蛋白尿、發揮抗DN作用。