miR-214調控的凋亡在肝纖維化中的作用

劉立朋，張秀利，張秀英*

(1.首都醫科大學 人體解剖與組織胚胎學系，北京100069；2.吉林大學中日聯誼醫院 新民胸外科)

細胞凋亡(apoptosis)對維持機體正常生理功能起到重要作用[1]。有文獻揭示Bim可通過其下游蛋白導致線粒體膜上Bax/Bak發生寡聚化[2]，引起線粒體膜的通透性改變，釋放細胞色素C(cyt C)，激活凋亡蛋白 Caspases(如Caspase-3)誘導細胞凋亡[3]。同時有文獻指出，miR-214 可以抑制骨肉瘤細胞及過氧化氫誘導的心肌細胞的凋亡[4,5]。本研究旨在探討miR-214調控的凋亡在肝纖維化小鼠中的調節作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1C57BL/6 小鼠(動物許可證號:SCXK2012

0001)于維通利華公司購買，小鼠為雄性，體重18-22 g，6周齡，SPF級，于首都醫科大學動物房規范化飼養。

1.1.2主要試劑 H&E試劑盒，天狼猩紅試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)； miR-214 agomir negative control，miR-214 agomir由北京歐林格生物科技有限公司合成；RNA 提取試劑Trizol；鼠抗α-SMA單克隆抗體(sigma)；兔抗Caspase-3單克隆抗體(CST)；羊抗兔 IgG-HRP，羊抗鼠 IgG-HRP(CST)；micro-RNA 逆轉錄試劑盒(Taqman)；PVDF 膜 (Merck Millipore)；ECL發光液(Bio-red)。

1.2 方法

1.2.1肝纖維化動物模型制作 24只6周齡雄性 C57BL/6 小鼠(北京維通利華實驗動物有限公司)，以每組12只隨機分為兩組。實驗組采用四氯化碳腹腔注射誘導肝纖維化，以1∶9的比例將四氯化碳溶于橄欖油中，按體重給予1 mL/kg，每周兩次，進行腹腔注射，對照組僅用橄欖油進行腹腔注射。四氯化碳注射6周時，采用尾靜脈注射方式，對照組注射 miR-214 agomir negative control ，實驗組注射 miR-214 agomir每周注射一次，每次 1 nmol，共注射兩周。待造模8周時對小鼠進行取材，部分肝組織放于 10% 福爾馬林溶液中用于石蠟包埋進行形態學染色；部分組織存放于-80℃超低溫冰箱用于 Western blot；少量組織存放于-20℃冰箱RNlater溶液中用于 Real-time 檢測。

1.2.2形態學染色 肝組織放于10%福爾馬林液中固定至少48小時后，進行常規脫水、透明和石蠟包埋。以4 μm厚度進行石蠟組織切片，用于HE和天狼猩紅染色，光學顯微鏡下檢測其病理程度并照相。

1.2.3Western blot檢測α-SMA 和 Caspase 3 的表達 造模6周時取實驗組和對照組各 40 mg,加入 650 μl RIPA 蛋白裂解液，冰上充分勻漿裂解，提取總蛋白液。對蛋白液進行變性后，取約30 μg蛋白進行10% SDS-PAGE 電泳，后以 300 mA 恒流轉印至PVDF 膜。5% BSA 室溫封閉一小時，第一抗體α-SMA和Caspase 3(均為1∶3 000稀釋)于4℃過夜孵育，第二抗體(1∶4 000稀釋)室溫孵育1小時。使用FUSION FX7曝光儀器(法國VilberLourmat公司 )掃描并采集圖像。

1.2.4實時定量PCR 檢測(Real-time PCR) 使用Trizol提取細胞或保存于RNlater溶液中的肝臟組織總 RNA，并根據供銷商提供方案對總 RNA 進行 DNase I(北京全式金生物技術公司)處理。采用頸環引物將 RNA 逆轉為與 miR-214 對應的 DNA，在 ABI 公司 7500 儀器中使用 SYBR Green Master mix 體系進行檢測，將相應 CT 值(2-△△ CT)進行統計并分析。實時定量PCR及逆轉錄所用頸環引物microRNA 引物見表1。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.2.5統計學分析 采用SAS 9.4統計軟件進行統計分析，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗組纖維化明顯

造模6周時進行取材，H&E及天狼星紅染色結果顯示(圖 1)：HE染色顯示對照組未見纖維增生，肝臟組織形態結構正常；而實驗組肝臟組織纖維增生, 同時伴隨一定的炎性細胞浸潤。天狼猩紅染色顯示實驗組纖維增生明顯，可見明顯染色成紅色的纖維間隔。以上實驗結果顯示，肝纖維化模型造模成功。

A,對照組H&E 染色； B,實驗組H&E染色； C,對照組天狼猩紅染色；D,實驗組天狼猩紅染色

2.2 肝纖維化小鼠肝組織內miR-214 表達量顯著下降

四氯化碳注射4，6，8周后取材，實時定量 PCR 結果顯示與對照組相比，實驗組 miR-214 在第4周時上升，但無統計學意義。第6周和8周時表達量顯著下降，P<0.01(圖 2)。

2.3 miR-214 agomir干預組小鼠纖維化得到改善

Western blot 結果顯示miR-214 agomir干預組纖維化標志蛋白α-SMA相較于 miR-214 agomir negative control 組表達量顯著下調。同時，我們發現 miR-214 agomir干預組凋亡蛋白Caspase-3 表達顯著下調(圖 3)。

3 討論

肝纖維化是一個極其復雜的病理過程，各種病因引起的慢性肝損傷均會導致肝臟進行修復愈合，在此修復過程中會導致肝實質細胞和門靜脈區細胞外基質沉積。如果不能及時去除病因阻斷肝纖維化進展，則可能進展為不可逆轉的肝硬化甚至肝癌等終末期疾病。但是目前尚無臨床上證實的有效治療手段。因此對肝纖維化發病機制進行深入研究，阻斷其進一步發生發展，仍然具有重大的臨床意義。

圖2 實時定量PCR 檢測兩組小鼠肝組織中miR-214基因表達水平

圖3 免疫印跡檢測兩組小鼠肝組織中α-SMA以及Caspase 3蛋白的表達

大量研究揭示 MicroRNA 在慢性肝病及肝纖維化中發揮重要作用[6]。 miR-214 做為纖維化的調節分子引起了廣泛關注[7]，有研究指出在不同器官以及肝纖維化/肝硬化不同階段，肝組織 miR-214 表達是不同的。有文獻報道肝組織 miR-214 高表達促進纖維化[8,9]，同時也有文獻指出在纖維化的早期階段肝組織 miR-214 表達下調[10]。本研究顯示在四氯化碳造模4周時，miR-214 表達上調但無統計學差異，這與本課題組前期基因芯片結果相符[11]。但在造模第6周及8周時 miR-214表達顯著下調。我們的結果也印證了上述觀點，即在肝纖維化不同階段 miR-214 表達是不同的。這也提示我們，要對 miR-214 在不同纖維化階段進行更進一步的檢測，明確其不同階段的作用。

有文獻指出 miR-214 與細胞凋亡密切相關，例如，miR-214 可通過對下游靶基因AIFM2 或 PTEN 基因調控抑制細胞凋亡[12,13]。更有文獻進一步指出，在胰腺癌中Caspase 3 表達升高促進凋亡[14]。我們發現miR-214 agomir干預組小鼠肝臟凋亡蛋白 Caspase 3 以及α-SMA 表達下調。我們推測 miR-214 agomir干預后小鼠肝臟凋亡受到抑制，從而減輕了肝臟炎癥反應，抑制了纖維化。然而 miR-214 在肝纖維化不同階段的調控作用，仍需深入研究，以便為臨床肝纖維化治療提供依據。