基于Wnt信號通路研究骨康方對過表達DKK1大鼠骨形成影響

盧義 張文財 萬雷 黃宏興

1. 廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510405 2. 廣州中醫藥大學附屬骨傷科醫院骨科，廣東 廣州 510240

骨質疏松癥(osteoporosis，OP) 是常見的骨代謝性疾病，主要特點為單位體積內骨量減少，皮質骨變薄，海綿骨骨小梁數目及大小均減少，骨髓腔增寬，骨骼載荷能力減弱。隨著年齡的增加，發生骨折的風險也相應增加。到2017年末，我國60歲以上的人口為2.4億，占總人口17%。老齡人口還在以每年800萬人的速度增加，預計至2050年，老齡人口將達到總人口的1/3[1]。Wnt信號通路是與骨代謝關系密切的一個重要信號通路，它與骨質疏松癥密切相關。Dickkopf相關蛋白1(dickkopf related protein 1，DKK1)是Wnt信號通路的抑制因子，在骨形成過程中起重要作用，被視為骨質疏松、骨修復的治療靶點[2]。本課題組在前期研究了骨康方干預過表達DKK1骨細胞的影響，結果顯示骨康方含藥血清可以提高細胞活性,提高BMP2的相對表達量，有利于成骨細胞的礦化，尤其在過表達DKK1干預后[3]。但骨康方對過表達DKK1生物體的效果如何還未見報道，本研究將從Wnt信號通路的方向，研究其對過表達DKK1大鼠骨形成的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選取3月齡SPF級雌性SD大鼠18只，體重(245±25)g，均購于廣州中醫藥大學動物實驗中心(合格證：SCXK(粵)2013-0034)。飼養于室溫24～28 ℃, 相對濕度為55%～65%,自由攝食水，每天照明12 h, 黑暗12 h。對動物的整個處置過程符合科技部《關于善待動物的指導性意見》要求。骨康方(熟地黃10 g、淫陽藿 10 g、大棗10 g、肉蓯蓉10 g、丹參 10 g、當歸10 g、補骨脂 10 g、菟絲子 10 g、白芍 10 g、黃芪 10 g)由廣州中醫藥大學附屬骨傷科醫院提供并制成水煮液(1.43 g /mL生藥)。

1.2 儀器和試劑

Trizol (Thermo公司)，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(Takara 公司)，Mini BEST Universal RNA Extraction Kit(Takara 公司)，Microseal B seal、Hard-Shell PCR Plate3 96-Well(Takara 公司)，Primescript RT Master Mix(Takara 公司)，異丙醇(廣州化學試劑廠)，氯仿(廣州化學試劑廠)，超凈操作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)，水合氯醛(廣州化學試劑廠)，TC-3 K 電子天平(深圳市華恒科技有限公司)，隔離獨立空氣換氣系統IVC(馮氏實驗動物設備有限公司)，掃描儀[MICROTEK (Bio-5000)]，高速冷凍離心機(Sigma)，PCR儀(Bio-Rad)，漩渦混合器(海門市其林貝爾儀器)，CFx96 TouchTM Real Time PCR Detection(Bio-Rad)，T100 Themal Cycler(Bio-Rad)，NanoDrop ND-2 000分光光度計(NanoDron Technologies)，Hologic discovery A骨密度儀(Hologic,美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1大鼠分組及腺病毒轉染：將大鼠隨機分為A 空白對照組(NC)，B 空載腺病毒組(Ad-EV)，C 過表達DKK1腺病毒感染組(Ad-DKK1)，每組6只,用苦味酸標為1～6號；分別用空載腺病毒(Ad-EV)和重組腺病毒(Ad-DKK1)感染B組、C組，腺病毒構建方法參考前期研究基礎[4]。病毒液解凍后，吸取1 260 μL的0.9%無菌生理鹽水至各組滴度為1011包裝好的病毒液中，使之成為滴度為1010的病毒液；用一次性1 mL注射器吸取200 μL病毒液，通過腹腔注射轉染大鼠。過表達DKK1腺病毒轉染組腹腔注射過表達DKK1腺病毒，空載腺病毒組腹腔注射空載腺病毒，空白對照組注射相同體積的生理鹽水。1周后對大鼠進行眼眶采血，PCR驗證腺病毒轉染成功。腺病毒轉染1個月后[5]開始中藥干預，灌胃給藥容積為10 mL/kg，每組1～3號按4.8 g/kg灌胃中藥[6]，4～6號灌等體積生理鹽水，所用藥物以蒸餾水定容至所需濃度，每天灌胃2次，間隔5 h，連續灌胃2個月。

1.3.2取材及測定骨密度：中藥灌胃2個月后，水合氯醛麻醉，頸椎脫臼處死。取大鼠股骨，左側股骨浸入4%多聚甲醛液中固定，右側股骨放置無菌凍存管，液氮凍存備用。將浸在甲醛中的股骨用Hologic discovery A骨密度儀及儀器自帶動物軟件測定骨密度，使用軟件中“局部放大”功能測定股骨骨密度，誤差系數(CV值)：1%。液氮中的股骨提取RNA后PCR驗證。

1.3.3RT-PCR 檢測：參照美國國立生物技術信息中心(NCBI)公布的cDNA設計上下游引物，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。總RNA提取：液氮中取出股骨，取松質骨50 mg，液氮研磨至粉狀，TRIZOL法提取總RNA，反轉錄合成cDNA。PCR 反應液的配制：SYBR? Premix Ex Taq II(TliRNaseH Plus)7.5 μL，PCR Forward Primer(10 μmol/L)0.5 μL，PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0.5 μL，cDNA 2.0 μL，dH2O 4.5 μL，PCR反應：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s，40 個循環。采用 2-△△Ct法統計分析。△Ct=Ct目的基因-Ct內參基因， △△Ct=△Ct待測樣品中目的基因-△Ct對照樣品中目的基因，相對樣品模板量=2-△△Ct。引物序列見表1。

圖1 骨康方對DKK1、ACTIN表達影響Fig.1 Effect of Gukang recipe on DKK1 and ACTIN

表 1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4 統計學處理

實驗數據采用SPSS 20.0軟件進行統計分析，結果以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，組間比較采用單因素方差分析，以P<0. 05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 轉染后大鼠血液中DKK1表達量

結果顯示，Ad-DKK1組DKK1表達量明顯高于NC組(P<0.05)和Ad-EV組(P<0.05)，腺病毒轉染成功，見表2。

表 2 大鼠血液DKK1表達量Table 2 DKK1 expression in rat blood

注:與NC組比較，#P<0.05; 與Ad-EV組比較，*P<0.05。

2.2 各組大鼠股骨BMD變化

結果顯示，過表達DKK1組(Ad-DKK1)股骨BMD均低于NC組、Ad-EV組(P<0.05)；在NC組、Ad-EV組、Ad-DKK1組內，骨康方灌胃大鼠BMD均高于生理鹽水灌胃(NS)大鼠(P<0.05)；空白對照組(NC)和空載腺病毒組(Ad-EV)無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表 3 大鼠BMD分析(g/cm2)Table 3 Analysis of BMD in each group (g/cm2)

注:與NC組比較，#P<0.05; 與 Ad-DKK1組灌胃NS比較，*P<0.05。

2.3 骨康方對大鼠Wnt通路相關因子的影響

結果顯示在各組內，骨康方灌胃大鼠APC mRNA 相對表達量均低于生理鹽水灌胃(NS)大鼠(P<0.05)；在組間，Ad-DKK1組APC mRNA 相對表達量均高于NC組、Ad-EV組(P<0.05)。見表4～表8。

表 4 APC mRNA 相對表達量Table 4 Relative expression APC mRNA

注:與NC組比較，#P<0.05; 與 Ad-DKK1組灌胃NS比較，*P<0.05。

圖2 骨康方對APC mRNA表達影響Fig.2 Effect of Gukang recipe on APC mRNA

圖3 骨康方對LRP6表達影響Fig.3 Effect of Gukang recipe on LRP6

由表5可見，在各組內，灌胃骨康方大鼠LRP6 mRNA相對表達量均高于灌胃生理鹽水(NS)大鼠(P<0.05)；在組間，Ad-DKK1組LRP6 mRNA相對表達量均低于NC組、Ad-EV組(P<0.05)。

由表6可見，在各組內，骨康方灌胃大鼠β-catenin mRNA相對表達量均高于生理鹽水灌胃(NS)大鼠(P<0.05)；在組間，Ad-DKK1組β-catenin mRNA相對表達量均低于NC組、Ad-EV組(P<0.05)。

表 5 LRP6 mRNA 相對表達量Table 5 Relative expression LRP6 mRNA

注:與NC組比較，#P<0.05; 與 Ad-DKK1組灌胃NS比較，*P<0.05。

表 6 β-catenin mRNA 相對表達量Table 6 Relative expression β-catenin mRNA

注:與NC組比較，#P<0.05; 與 Ad-DKK1組灌胃NS比較，*P<0.05。

由表7可見，在各組內，骨康方灌胃大鼠RUNX2 mRNA相對表達量均高于生理鹽水灌胃(NS)大鼠(P<0.05)；在組間，Ad-DKK1組RUNX2 mRNA相對表達量均低于NC組、Ad-EV組(P<0.05)。

圖4 骨康方對β-catenin表達影響Fig.4 Effect of Gukang recipe on β-catenin

表 7 RUNX2 mRNA 相對表達量Table 7 Relative expression RUNX2 mRNA

注:與NC組比較，#P<0.05; 與 Ad-DKK1組灌胃NS比較，*P<0.05。

由表8可見，在各組內，骨康方灌胃大鼠OPG mRNA相對表達量均高于生理鹽水灌胃(NS)大鼠(P<0.05)；在組間，Ad-DKK1組OPG mRNA相對表達量均低于NC組、Ad-EV組(P<0.05)。

圖5 骨康方對RUNX2表達影響Fig.5 Effect of Gukang recipe on RUNX2

表8 OPG mRNA 相對表達量Table 8 Relative expression OPG mRNA

注:與NC組比較，#P<0.05; 與 Ad-DKK1組灌胃NS比較，*P<0.05。

圖6 骨康方對OPG表達影響Fig.6 Effect of Gukang recipe on OPG

2.4 骨康方對DKK1、OPG蛋白的影響

由Western blot結果可見：①過表達DKK1抑制OPG表達；②與灌胃生理鹽水比較，灌胃骨康抑制DKK1蛋白表達，促進OPG蛋白表達。

圖7 骨康方對DKK1、OPG蛋白的影響注：NC:空白對照組。Ad-EV：空載腺病毒組。Ad-DKK1:過表達DKK1組。GK:骨康。NS：生理鹽水。Fig.7 Effect of Gukang recipe on DKK1 and OPG protein

3 討論

中醫對骨質疏松癥有著獨到的見解，骨質疏松在中醫屬“骨痿”。中醫認為骨痿與腎、脾、肝、血瘀密切相關。骨康方以補骨脂為君藥，熟地、淫羊藿、白芍為臣藥，共奏補腎壯骨、滋陰益精之效。有學者[7]認為腎精與骨髓間充質干細胞在來源、功能上有許多相似性, 骨髓間充質干細胞及其功能是腎精在細胞水平上的表現形式，腎精虧虛導致的骨質疏松癥必定影響到骨髓間充質干細胞及其功能，而補腎中藥具有干預骨髓間充質干細胞的作用。現代醫學[8]已經證實補腎中藥可以通過調節Wnt/β-catenin信號通路促進成骨細胞增殖分化。曹大林等[9]研究后認為，補骨脂能夠明顯提高骨密度，上調β-catenin蛋白表達,激活Wnt信號通路。脾主四肢，為后天之本，氣血生化之源，脾虛是骨質疏松癥發生的重要因素。正如朱丹溪[10]所述：“大抵脾胃虛弱，陽氣不能生長……則骨乏無力，令人骨髓空虛，足不能履地”。所以治骨痿，健脾是關鍵，骨康方配以黃芪補脾益氣。歐莉等[11]研究后認為，熟地配伍黃芪能激活Wnt/LRP/β-catenin信號通路，降低破骨細胞活性，促進成骨細胞生成,達到調節骨代謝的目的。人體的氣和血周流于全身，是臟腑經絡包括骨骼等一切組織器官進行生理活動的物質基礎。《靈樞·本臟》中描述道：“氣滯不行，營運無力……筋骨失養。”骨康方以當歸、丹參活血通絡，達到補中寓通、補而不滯的目的。楊亞軍[12]認為，丹參素能直接上調經典Wnt/β-catenin/Tcf信號通路，或者通過抑制FoxO3a信號通路間接促進Wnt通路的激活，從而調控成骨分化功能,發揮抗骨質疏松作用。

骨康方對治療脾腎陽虛型、肝腎陰虛型、氣滯血瘀型骨痿有很好的療效[13-14]，但是其具體的作用機制還有待進一步研究。王凡[15]的研究表明，骨康方含藥血清可以提高細胞活性，降低鈣離子濃度，抑制細胞的凋亡，有利于成骨細胞礦化，尤其在過表達DKK-1干預后。本課題組前期在細胞水平方面研究了骨康方對過表達DKK1骨細胞的影響，本研究基于Wnt信號通路研究骨康方在過表達DKK1生物體內的影響。結果顯示過表達DKK1會抑制Wnt信號通路，Wnt信號通路受體LRP6 mRNA表達量降低，細胞內APC含量升高，與Axin、GSK-3β和β-catenin形成復合體，降解β-catenin，使得下游RUNX2和OPG mRNA表達量降低。給予骨康方干預的大鼠較無骨康方干預大鼠骨密度升高，Wnt信號通路抑制因子DKK1、APC表達量降低，Wnt信號通路中LRP6、β-catenin、RUNX2和OPG表達量升高。Wnt/β-catenin信號通路是一條經典信號通路，它具有調控骨的代謝包括成骨細胞的增殖和分化等功能，激活Wnt/β-catenin信號通路可以促進成骨細胞增殖分化[16]。有實驗[17-18]證明，在骨髓間充質干細胞中，Wnt信號在骨質疏松癥期間持續受到抑制。DKK家族是一組分泌型糖蛋白，共有4種：DKK1、DKK2、DKK3 和DKK4[19]。DKK1基因在骨疾病、腫瘤及腎臟、肝臟中發揮重要作用，同時也是Wnt/β-catenin 信號通路抑制劑，通過與脂蛋白相關蛋白受體6(LRP6)形成復合物，使LRP內化和降解，以此降低LRP和Wnt配體的結合率[20-21]。DKK1與LRP6的結合使細胞內糖原合成激酶-3β(GSK-3β)、腺瘤息肉蛋白(APC)、軸抑制蛋白(Axin)含量升高，并形成降解復合體，降解β-catenin[22]。研究[23]表明，當β-catenin在胞質中達到穩定水平時，便可進入核內，與T細胞因子/淋巴增強因子(t cell factor/lymphoid enhancing factor，TCF/LEF)結合,調節Runx2等骨靶基因的表達，進而促進成骨細胞分化。沒有β-catenin向細胞核內轉移積累，β-catenin就無法通過與 TCF/LEF 結合，從而促進下游RUNX2、OPG等靶基因的表達[24]。Runx2(runt-related transcription factor 2) 是促進骨形成的關鍵調控因子，通過調控成骨細胞特異性細胞外基質蛋白基因的表達和成骨細胞周期參與成骨細胞的分化過程，促進骨形成和抑制骨吸收[25]。骨保護素(OPG)是調節骨重建過程中破骨細胞功能的重要調節因子，OPG可以抑制破骨細胞功能,減少骨質破壞[26]。

綜上，過表達DKK1可導致大鼠股骨骨密度降低，骨康方可以通過促進Wnt信號通路中LRP6、β-catenin、RUNX2、OPG基因的表達促進成骨，抑制Wnt信號通路抑制因子DKK1的表達，為骨康方治療骨質疏松癥提供了新的動物實驗依據，但其起主要作用的成分以及治療骨質疏松的其他機制還有待進一步研究。