樣本溶血對血漿中16種氨基酸測定準確性的探究

陳逢斌 任瑩 趙勝軍

摘要：為探究樣本溶血對國標酸解法測定血漿中16種氨基酸含量的影響，采集60份斷奶仔豬頸動脈血液并分為3組，即普通溶血組、機械溶血組與對照組，普通溶血組為血液采集后溶血樣本，機械溶血組為血液采集后經超聲波處理溶血再離心樣本，未溶血血漿為對照組。采用賽卡姆S433D全自動氨基酸分析儀檢測血漿樣本中天冬氨酸（Asp）、蘇氨酸（Thr）、絲氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、脯氨酸（Pro）、賴氨酸（Lys）、組氨酸（His）、精氨酸（Arg）的含量。結果表明，普通溶血組Asp、Ala、Val、Leu、His、Lys含量相較于其余兩組顯著升高（P<0.05），其余10種氨基酸含量相較于對照組偏高或偏低（P>0.05）。說明血樣溶血對其氨基酸含量存在較大影響，且受非血紅蛋白因素影響較小，為了盡可能避免或減少溶血的發生，建議采血操作以及樣品的運送、分離檢測嚴格規范，以提高測定的準確性。

關鍵詞：血漿；溶血；氨基酸；準確性

中圖分類號：R446.1 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2019）02-0005-03

血液樣本溶血會直接導致生化指標檢測出現偏差，從而引發測定誤差以及其他問題[1]。近年來，在醫療領域中血液氨基酸指標可用于篩查苯丙酮尿癥、先天性甲狀腺功能低下等疾病[2]，科研中作為血液標記物輔助診斷中樞神經系統腫瘤以及胃癌[3，4]，并可用于評估動物腸道健康以及營養物質代謝水平[5，6]。血液的特殊性致使測試血漿樣本彌足珍貴，而在實際操作中卻因溶血問題導致樣本被棄用或者測定值不可用，給醫療和科研帶來巨大損失。因此，探究血液樣本溶血對其氨基酸含量的影響并加以分析能夠使篩查或者評估更加精準。吳小平[7]對溶血導致臨床生化檢驗結果偏差進行了研究，表明溶血對血液中葡萄糖、天冬氨酸轉氨酶、谷丙轉氨酶、尿酸等有顯著影響。大量研究表明，溶血因素對血液指標測定準確性有較大影響，而分析原因后提出的校正方法主要是規避采血時的不規范操作，并利用回歸方程校準數據[8-10]。在此基礎上，本試驗對血液樣本溶血對茚三酮柱后衍生法測定氨基酸含量的影響以及是否因非蛋白基底因素影響氨基酸含量進行了探討，并根據試驗結果對溶血樣品氨基酸測定進行了分析并提出了解決對策。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用血液樣本來自30頭21日齡斷奶仔豬。

1.2 儀器和試劑

Sykam S433D全自動氨基酸測試儀，試劑均為Sigma試劑公司生產。

1.3 方法

將60份血液樣本分為3組，即普通溶血組、機械溶血組及對照組，對照組為未溶血樣本制得血漿，普通溶血組為采血后發生溶血樣本制得血漿，機械溶血組為未溶血樣本經超聲波處理后再離心制得血漿。以超聲波進行機械處理模擬因物理因素導致的溶血[11]，離心后從而排除溶血后血紅蛋白因素的影響，探究是否因非血紅蛋白物質及其他因素導致血液溶血后對氨基酸含量測定造成影響。

1.4 試驗原理

酸水解法測定氨基酸具體方法按照GB/T 18246-2000執行[12]，測定血漿中天冬氨酸（Asp）、蘇氨酸（Thr）、絲氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、脯氨酸（Pro）、賴氨酸（Lys）、組氨酸（His）、精氨酸（Arg）的含量。

1.5 數據的統計分析

試驗數據使用Excel 2013統計整理，采用SAS軟件包并選擇GLM模型對數據進行ANOVA單因素方差分析。分析結果采用平均值±標準誤表示，以P<0.05為差異顯著性標準。

2 結果與分析

茚三酮柱后衍生測定水解氨基酸含量結果見表1。由表1可見，相較于對照組不溶血樣本以及機械溶血組超聲波溶血樣本，普通溶血組即采集后發生溶血的血漿中Asp、Ala、Val、Leu、His、Lys含量顯著升高（P<0.05），且Thr、Ser、Glu、Gly、Phe、Pro、Arg的含量也偏高（P>0.05）；普通溶血組的Tyr、Met、Ile含量低于或等于對照組，但與機械溶血組無顯著性差異（P>0.05）。機械溶血組的Asp、Thr、Ser、Glu、Gly、Ala、Val、Leu、Phe、Pro、Lys、His、Arg含量均與對照組無顯著性差異（P>0.05），但Tyr、Met、Ile含量卻低于對照組（P>0.05）。

3 討論

溶血，即紅細胞破裂，致使血紅蛋白散出到血漿或者血清中[13]。其主要表現為血漿或者血清顏色和密度的變化，一般為粉紅色或者紅色，溶血血漿中血紅蛋白和其他生理成分增加，其密度受到影響[14]。而血紅蛋白主要成分也是蛋白物質，在酸解法下分解為氨基酸或者小肽，導致血漿中氨基酸測定值偏高，這與本試驗的大致趨勢一致。動物機體中的Asp主要參與細胞代謝和生理作用，直接作用在于合成嘌呤、嘧啶以及其余可轉氨作用合成的氨基酸[15]；而Ala主要參與能量供應的糖異生過程以及葡萄糖-丙氨酸循環，并在器官間的碳氮代謝和運輸中起到重要作用[16]；Val作為生糖氨基酸可以進入三羧酸循環進行供能，且為蛋白質合成前體物質[17]；Leu主要功能為促進蛋白質合成[18]；His則直接為肌蛋白和球蛋白的組成成分[19]；Lys作為豬的第一限制性氨基酸可直接參與氮代謝中NO的合成[15]。這6個氨基酸涉及到機體各個器官的供能與氮代謝，從而也就說明為什么本試驗中普通溶血組Asp、Ala、Val、Leu、His、Lys含量相較于對照組顯著升高。但是普通溶血組中Met、Ile、Tyr的含量卻小于或等于對照組，這可能與機體各個組織器官細胞的氨基酸基底含量和吸收利用量有很大關聯[20]。而本試驗中機械溶血組除Met、Ile、Tyr以外的其余13種氨基酸含量均與對照組無明顯差異，由此可見在溶血過程中由非蛋白基底物質因素引起的變異較小，更多的可能來源于蛋白基底物質、采血速度或者采血時產生的泡沫等其他方面[21]。

溶血發生的原因比較復雜，有可能發生在采集過程中或者采集后儲存過程中抑或是測定過程中[21]。首先可以明確的是，血漿的來源也就是動物機體的免疫狀態對血漿中的各種應激物質或激素水平有很大影響；其次，在血液樣本采集過程中有很多原因可以導致溶血：抽血針頭大小、采集位點、進針角度、抽血速度、血液聚集過程中的泡沫問題以及運送過程的顛簸等；再者，儲存不當或重復凍融以及解凍時的外界溫度都可以對血液的溶血產生影響。而在實際血樣指標測定過程中，有更多問題可以影響到最終結果，如測定周期長而且可能涉及到轉移多次等問題。這也很好地印證了在某一項臨床試驗中調查顯示溶血樣本達到1.98%這一結果[22]。

總而言之，溶血的原因眾多，但在國標水解法測定血漿中氨基酸的試驗中大致可以排除血紅素以及其他非血紅蛋白因素的影響，更多的可能與紅細胞破裂后釋放的血紅蛋白以及蛋白基底因素密切相關。以此對血漿樣品氨基酸含量的測定提出建議：①動物試驗中保證可控因素一致，減少機體免疫誤差。②采集血樣時統一位點并熟練操作、進針角度控制以及時刻關注血液流出速度、運送過程中確保平穩。③統一標準化儲存、減少凍融次數。④減少轉樣次數，并及時上機測定。

4 結論

本試驗得出如下結論：①相較于正常血漿，溶血樣本中16種氨基酸含量絕大部分顯著升高。②進一步研究表明溶血樣本中非血紅蛋白因素對氨基酸含量的影響較小。

參考文獻：

[1] HUGHES N C，BAJAJ N，FAN J，et al. Assessing the matrix effects of hemolyzed samples in bioanalysis[J].Bioanalysis，2009，1（6）：1057-1066.

[2] 周艷和.新生兒疾病篩查足跟采血法的護理研究進展[J].中西醫結合護理（中英文），2016，2（6）：217-219.

[3] 張春燕，程昱璇，趙振宇，等.基于代謝組學評價血液生物標志物對中樞神經系統腫瘤的診斷價值[J].標記免疫分析與臨床，2017，24（6）：601-605.

[4] 修風民，張 鳳，矯健鵬，等.胃癌患者血漿24種氨基酸代謝物水平變化[J].第二軍醫大學學報，2018，39（1）：62-67.

[5] 祝 倩，查 偉，姬玉嬌.母豬飼糧添加脯氨酸對哺乳環江香豬血漿生化參數和氨基酸含量的影響[J].華南農業大學學報，2018，38（1）：7-11..

[6] 蔡萬存，李向飛，蔣廣震.大米蛋白替代魚粉對團頭魴生長、腸道消化吸收功能以及氨基酸代謝的影響[J].南京農業大學學報，2017（3）：529-538.

[7] 吳小平.探討溶血對臨床生化檢驗結果的影響[J].中國醫藥指南，2018（10）：42-43.

[8] 謝紹霞.溶血對生化檢驗結果準確性的影響及校正方法分析[J].中外女性健康研究，2018，9（17）：111，166.

[9] 趙 東.溶血對生化檢驗結果準確性的影響及校正方法分析[J].檢驗醫學與臨床，2012，9（16）：2024-2025.

[10] 陳紅琴.溶血對生化檢驗準確性的影響及糾正探析[J].現代診斷與治療，2014，1（2）：387.

[11] 蔡 君.豬血生物法制備血紅素及珠蛋白肽的工藝研究[D].武漢：湖北工業大學，2013.

[12] GB/T 18246-2000飼料中氨基酸的測定[S].

[13] 劉小娟，杜曉琳，黃 娟，等.生物分析中溶血對檢測的影響及其對策[J].中國新藥與臨床雜志，2017（4）：7-11.

[14] LAGA A，CHEVES T，MAROTO S，et al. The suitability of hemolyzed specimens for compatibility testing using automated technology [J].Transfusion，2008，48（8）：8.

[15] WU G，BAZER F W，DAI Z，et al. Amino acid nutrition in animals：Protein synthesis and beyond[J].Annual Review of Animal Biosciences，2014，2（1）：387.

[16] FAN Q，YAN X，YIN Y，et al. Amino Acids，Gene Expression，and Cell Signaling in the Pig Intestine[C].Nutritional and Physiological Functions of Amino Acids in Pigs[M].Vienna：Springer，2013.

[17] MAVROMICHALIS I，KERR B J，PARR T M，et al. Valine requirement of nursery pigs[J].Journal of Animal Science，2001， 79（5）：1223-1229.

[18] ESCOBAR J，FRANK J W，SURYAWAN A，et al. Physiological rise in plasma leucine stimulates muscle protein synthesis in neonatal pigs by enhancing translation initiation factor activation[J].American Journal of Physiology Endocrinology & Metabolism，2005，288（5）：E914-921..

[19] PAN L，MA X K，WANG H L，et al. Enzymatic feather meal as an alternative animal protein source in diets for nursery pigs[J].Animal Feed Science & Technology，2016，212：112-121.

[20] ROMAN Y，BOMSEL-DEMONTOY M C，LEVRIER J，et al. Effect of hemolysis on plasma protein levels and plasma electrophoresis in birds[J].Journal of Wildlife Diseases，2009，45（1）：73-80.

[21] TAN A，GAGN？魪 S，L？魪VESQUE I A，et al. Impact of hemolysis during sample collection：How different is drug concentration in hemolyzed plasma from that of normal plasma？[J].Journal of Chromatography B，Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences，2012，901（none）：79-84.

[22] TANG D，THOMAS E. Strategies for dealing with hemolyzed samples in regulated LC-MS/MS bioanalysis[J].Bioanalysis，2012，4（22）：2715-2724.