介質阻擋低溫等離子處理對花生蛋白持水性及溶解性的影響

季 慧，于嬌嬌，張 金，魏 瑞，李書紅，陳 野

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介質阻擋低溫等離子處理對花生蛋白持水性及溶解性的影響

季 慧1,2，于嬌嬌1，張 金1，魏 瑞1，李書紅1，陳 野1※

（1. 天津科技大學食品工程與生物技術學院，教育部食品營養與安全實驗室，天津 300457；2. 臨沂大學生命科學學院，臨沂 276002）

花生蛋白營養豐富，但因功能性質差，導致其在食品工業應用受限。低溫等離子技術作為一種新興的、非熱、無危害技術，越來越受人關注，介質阻擋放電（dielectric barrier discharge，DBD）等離子體技術由于具有適應頻率寬，可在較大空間內獲得高密度非平衡等離子體，并且工藝簡單、快速高效、節能環保，是近年來蛋白質改性研究的熱點之一。采用介質阻擋低溫等離子體對花生蛋白溶液進行改性處理，研究等離子體處理時間對花生蛋白結構及功能特性影響。試驗結果表明：低溫等離子處理能顯著提高花生蛋白的溶解性、持水性，低溫等離子處理時間為2 min時，花生蛋白溶解性和持水性達最大，與未處理樣品相比分別提高了24.8%和79.6%；同時，花生蛋白乳化性、乳化穩定性、起泡性、起泡穩定性和持油性也有不同程度的提高。借助十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、傅里葉紅外光譜（Fourier transform infrared，FTIR）、表面疏水性分析低溫等離子對花生蛋白結構影響。分析結果表明，低溫等離子處理并未改變花生蛋白的分子量分布；低溫等離子處理后，-折疊和無規則卷曲的含量增加，-螺旋和-轉角的含量降低，蛋白的有序結構被破壞，結構由緊密變松散；花生蛋白表面疏水性顯著提高。低溫等離子處理是一種改善蛋白功能性質的有效方法。

蛋白；等離子；結構；低溫等離子；花生蛋白；功能性質

0 引 言

花生是世界上最重要的油籽作物之一，中國是世界上第二大花生生產國[1]。脫脂花生粉是一種富含蛋白質的花生油提取副產品，含有47%～55%的高質量蛋白質，其抗營養因子水平較低。然而，與大豆蛋白相比[2-3]，它的低溶解度、乳化、發泡和凝膠性能等不良的功能特性限制了花生蛋白在食品工業上的應用。改善花生粉的功能特性對提高其在食品工業中的應用至關重要。

為了提高花生蛋白的功能特性，國內外專家對花生蛋白的功能特性進行了一些物理和化學改性。其中包括酶解、高壓、超聲波處理、微射流、微波和糖基化處理[1,4-6]。這些方法確實可以在不同水平上提高花生蛋白的功能特性，同時容易引起反應產物復雜、熱變性和食品安全問題。尋求一種方便、快速、高效和綠色的新型改性技術是提高花生粉在食品工業利用率的關鍵問題。

低溫等離子體（cold plasma，CP）是一種全新的、無危害、無熱、高技術、前景廣闊的高新技術，目前在食品工業中備受關注。等離子體作為物質的除固態、液態、氣態之外的第四態，是氣體部分或完全電離產生的非凝聚體系，CP包括紫外光子、電子、正離子和負離子、自由基、激發態或非激發分子和原子，這些粒子可以破壞共價鍵并引發各種化學反應[7]。因為電能產生的高能電子直接作用于等離子體的電子元件，使得等離子體的處理組分保持在室溫[8-9]。CP已被廣泛應用于滅菌、表面改性、高分子功能化、不良創面愈合及脂質膜的改性[10-14]。由于它的高能量，CP處理可以在微米到納米范圍內改變材料的結構[8]，并作為一種很有前途的方法來處理材料表面，而不破壞它們的整體性能。研究表明[15-17]，低溫等離子能夠引起玉米及馬鈴薯淀粉、面粉、乳清蛋白的二級、三級結構的改變，從而改善蛋白的功能性質。然而低溫等離子改性花生蛋白的研究很少。

本文采用低溫等離子處理花生粉溶液，研究低溫等離子對花生蛋白結構及功能性質的影響，為提高花生粉在食品中的應用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

低溫脫脂花生粉購買于臨沂天申生物技術有限公司；血清白蛋白購買于華美生物工程有限公司。其他試劑都是分析純級。

1.2 儀器與設備

DBD-50低溫等離子體南京蘇曼等離子科技有限公司；Ultra-Turrax T25高速乳化剪切機，德國IKA公司；紫外分光光度計E-201-C-9上海羅素科技有限公司；電泳DY-6C北京六一儀器廠；傅立葉變換紅外光譜NicoletiS50 美國賽飛世爾科技有限公司；F-4500熒光分光光度計，日本HITACHI 公司；

1.3 試驗方法

1.3.1 花生蛋白等離子處理

低溫脫脂花生粉與去離子水配置成4 g/L的懸浮液于錐形瓶中，分散均勻后調整到pH值為10，放入冰箱（4 ℃）過夜充分水合備用。取10 mL花生蛋白溶液放入介質阻擋DBD-50反應器中處理，根據Dong等[18]報道，在預試驗結果的基礎上，選取放電等離子處理條件為，輸入電壓為35 V，在整個作用過程中，調節放電頻率使輸入電流維持在2 A，即輸入功率為70 W，放電距離8 mm，放電時間為0、1、2、3、4、5 min對脫脂花生蛋白溶液進行改性處理。取部分處理后的樣品真空冷凍干燥后備用。影響等離子處理效果的因素除了輸入功率和處理時間外，放電間距也是影響等離子處理效果的一個主要因素，在我們的預試驗中發現，隨著放電間距的增加，等離子作用效果急劇減弱；在本試驗中我們選取最小的放電間距8 mm，在固定輸入功率的條件下，研究了不同等離子處理時間對花生蛋白結構及功能的影響，對等離子作用花生蛋白的機理進行初探。低溫等離子體示意圖如圖1所示。

圖1 低溫等離子系統簡易示意圖

1.3.2 花生蛋白等離子處理后功能性質及結構的測定

1）溶解度

將等離子時間處理后花生蛋白溶液pH值調到10.00，采用考馬斯亮藍法[19]，以牛血清白蛋白作標準曲線，測定等離子處理后蛋白溶解度。

2）乳化性和乳化穩定性的測定

等離子處理后的溶液（pH值調到10.00）在4 000 rad/min的條件下離心10 min后，從上面取上清液15 mL，再加入5 mL液體石蠟。用高速剪切機以10 000 rad/min剪切1 min制得的乳狀液，立刻從底部吸取0.05 mL加到質量分數為0.1%的十二烷基硫酸鈉溶液中混合均勻，在波長為500 nm處測定吸光度記為0。10 min后從底部吸取0.05 mL加到質量分數為0.1%的十二烷基硫酸鈉溶液中混合均勻，在波長為500 nm處測定吸光度記為10。分別按照公式（1）計算花生蛋白的乳化活性指數（emulsion ability index，EAI）和公式（2）計算花生蛋白的乳化穩定性指數（emulsion stability index，ESI）[20]。

式中為稀釋倍數；為油體積分數，%；?為間隔時間，min；為溶液濃度, g/mL。

3）起泡性和起泡穩定性的測定

等離子處理后的溶液（pH值調到10.00）放置于30 ℃水浴鍋中保溫10 min，而后全部在4 000 rad/min的條件下離心10 min后，從上面取上清液20 mL，用高速剪切機以10 000 r/min的轉速剪切2 min，立即記下各瓶泡沫的體積（0，mL），靜置20 min后再次記下各瓶泡沫的體積（20，mL），按照公式（3）和（4）分別計算花生蛋白的起泡能力（foaming ability，FC）和花生蛋白的泡沫穩定性（foam stability，FS）[21]。

4）持水性和持油性的測定

分別稱取低溫等離子處理后的花生蛋白樣品0.5 g（1）于已知質量的離心管（2）中，再加入20 mL蒸餾水，攪拌使其充分在水中分散溶解，置于30 ℃恒溫水浴鍋保溫30 min。在4 000 rad/min的條件下離心10 min后，倒掉上清液，稱量離心管質量（3）。按照公式（5）計算花生蛋白的持水性（water-holding ability，WHC）。

稱取上述花生蛋白樣品0.5 g于已知質量的離心管中，加入20 mL液體石蠟，攪拌使其充分在液體石蠟中分散溶解，置于30 ℃恒溫水浴鍋中讓其保溫30 min。用4 000 r/min離心10 min后倒掉沒有被吸附的液體石蠟，稱量離心管質量（′3）。按照公式（6）算花生蛋白的持油性（oil absorbing capacity，OAC）[22]。

5）SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

采用還原型聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE）方法鑒定低溫等離子處理前后花生蛋白中亞基的變化情況。根據Ji等[23]方法，選取分離膠和濃縮膠的濃度分別為12%和4%，樣品中加入1 mmol/L-巰基乙醇。電泳后，蛋白膠用考馬斯亮藍R250染色。

6）傅里葉紅外光譜分析

準確稱量0.001 g花生蛋白樣品，加入一定量的KBr至0.15 g，用研缽研磨成均勻粉末，壓制成薄片，用傅里葉紅外光譜儀做全波段掃描（4 000～400 cm-1），掃描次數為32[24]。

7）表面疏水性的測定

采用ANS（1-苯胺基-8-奈磺酸）熒光探針法來測定花生蛋白的表面疏水性[25]，每個樣品經等離子處理后都稀釋為濃度梯度為0.2%、0.1%、0.05%、0.025%、0.012 5%的溶液，并配置8 mmol/L的ANS溶液。將40L ANS溶液加入到5 mL每種稀釋液中，使用熒光分光光度計在390 nm（激發）在470 nm（發射）的波長下測量每個稀釋液熒光強度，狹縫寬度為5 nm。縱坐標為各稀釋液的熒光強度，橫坐標為各稀釋液熒光強度對應的蛋白濃度作圖花生蛋白樣品的表面疏水性指數可以用所得直線的斜率來表示。

采用SPSS統計軟件（Version 19.0, SPSS Inc.， Chicago, IL, USA），通過單因素方差分析（ANOVA）驗證低溫等離子處理對花生蛋白特性有顯著性差異，<0.05認為有顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 等離子處理對pH值和溶解度影響

等離子處理對花生蛋白溶液pH值的影響如表1所示。由表1可知，隨著等離子對花生蛋白處理時間的增加，溶液的pH值顯著降低（<0.05），處理5 min后，pH值從10.00降到2.55。pH值下降的原因可以解釋為低溫等離子在放電過程中會產生大量的高能粒子使氧分子電離單分子氧，使NO氧化成NO2，生成亞硝酸（HNO2）和硝酸（HNO3），以及水分子與過氧化氫（H2O2）在空氣或液體中反應生成酸性H3O+離子。

表1 等離子處理對花生蛋白溶液pH值的影響Table 1 Effect of CP treatment on pH value of Peanut protein

注：采用 Duncan’s multiple range test 方法分析，同列小寫字母不同表示差異顯著（<0.05）

Note: Mean values in the same column with different letters are signi?cantly (<0.05) different, as determined by Duncan’s multiple range test.

由表1的結果可知，低溫等離子處理后，高能粒子電離介質（空氣）引起花生蛋白溶液pH值顯著下降，pH值是影響蛋白功能性質的重要因素之一，為探求低溫等離子對花生蛋白的結構與功能性質影響機理，消除溶液pH值對蛋白的影響，故在后續的試驗中，把等離子處理前后的溶液的pH值均調到統一值10.00。不同低溫等離子處理時間對花生蛋白溶解度的影響如圖2所示。蛋白質的溶解度會影響蛋白的其它功能性質，從而對其在食品工業中的使用產生影響。由圖2可知，花生蛋白的溶解度隨著等離子處理時間的增加呈先升高后略降低的趨勢，但都高于未處理時的蛋白溶解度。低溫等離子處理時間為2 min時，花生蛋白的溶解度最大為132.78 mg/L，比未處理時提高24.8%。花生蛋白溶解度增加可能是由于等離子放電產生的高能粒子的轟擊使蛋白表面產生刻蝕，花生蛋白表面結構被打開，蛋白比表面積增加，活性位點增加，加大蛋白膠束與水基團的碰撞幾率，同時，高能粒子促使大量的水基團被激發，在蛋白表面形成水膜，花生蛋白的溶解度增加。隨著等離子處理時間的延長，持續的放電可能使能引發花生蛋白不同的氨基酸側鏈的變化，如?SH基團。芳香型和含硫氨基酸側鏈尤其容易氧化，?SH或?S?CH3變成?S?S?[26-28]，引起蛋白之間的交聯，蛋白表面的活性位點減少，蛋白溶解度降低。

圖2 低溫等離子處理時間對花生蛋白溶液溶解度的影響

2.2 等離子處理對乳化性和乳化穩定性的影響

等離子處理時間對乳化性和乳化穩定性的影響如圖3所示。乳化性質表示蛋白質每單位質量界面區域穩定，表征蛋白質吸附到油-水界面的性質。由圖3可已看出，低溫等離子處理能顯著增加花生蛋白的乳化穩定性，適當的低溫等離子處理會在一定程度上增加花生蛋白的乳化性。在處理3 min內，隨著處理時間的延長，花生蛋白的乳化穩定性逐漸增加，3 min時達最大為38.95 m2/g，與未經處理的花生蛋白13.16 m2/g相比，乳化穩定性提高了196.2%。可能的原因是低溫等離子產生的高能粒子轟擊花生蛋白使表面結構破壞，疏水基團暴露，蛋白乳化穩定性增加[29]。3 min后，高能粒子的持續放電，引起蛋白之間的交聯，蛋白表面疏水性降低，乳化穩定性下降。

圖3 等離子處理時間對乳化性和乳化穩定性的影響

2.3 等離子處理時間對花生蛋白起泡性和泡沫穩定性的影響

等離子處理時間對花生蛋白起泡性和泡沫穩定性的影響如圖4所示。由圖4可知，花生蛋白的起泡性和泡沫穩定性都隨著等離子處理時間的增加呈先升高后降低的趨勢，在等離子處理時間為3 min時，花生蛋白的最大起泡能力為106.67%，泡沫穩定性為81.25%，與未處理樣品60.00%，38.89%相比分別提高了77.8%，108.9%。可能是由于適度的等離子處理使花生蛋白的結構變得較為疏散，蛋白分子間形成了比較穩定的界面膜，但是隨著處理時間的增加，蛋白分子間的界面膜由于破裂，所以起泡性和泡沫穩定性都降低。

圖4 等離子處理時間對花生蛋白起泡性和泡沫穩定性的影響

2.4 等離子處理時間對花生蛋白持水性和持油性的影響

等離子處理時間對花生蛋白持水性和持油性的影響如圖5所示。由圖5可知，花生蛋白的持水性隨著等離子處理時間的增加呈先增加后降低的趨勢，在等離子處理時間為2 min時，持水性最大為1.93 g/g，比未處理時增加79.6%，該結果與溶解性變化趨勢相一致。等離子處理前2 min，花生蛋白的持油性稍有降低，在等離子處理時間為3 min時，花生蛋白的持油性升高并達到最大值2.47 g/g，與蛋白乳化性變化趨勢相似。等離子處理對花生蛋白持水性和持油性的影響可能與等離子處理活性位點增加，花生蛋白表面結構變疏散，疏水基團被暴露有關。

圖5 低溫等離子處理對花生蛋白持水性和持油性的影響

2.5 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結果

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結果如圖6所示。由圖6可知，花生蛋白亞基的電泳圖譜包含5個主要類別：伴花生球蛋白（>50 kDa）、酸性花生球蛋白（38～49.9 kDa）、中分子量蛋白質（23～37.9 kDa）、堿性花生球蛋白（18～22.9 kDa）、低分子量的花生球蛋白（14～17.9 KDa）。與未處理的花生蛋白相比，等離子處理并沒有引起蛋白質電泳圖譜的重大變化，表明等離子處理并沒有改變花生蛋白的一級結構，并且花生蛋白和其他分子（蛋白質、碳水化合物、水膠束等）之間沒有形成共價鍵[30]。可能是因為本試驗選擇的放電功率下，高能粒子的能量并沒有引起蛋白亞基的變化，沒觸及蛋白肽鍵的斷裂和重組。

圖6 低溫等離子處理不同時間后花生蛋白的SDS-PAGE圖

2.6 傅里葉紅外光譜分析結果

選取紅外光譜中的酰胺Ⅰ帶（1 600～1 700 cm-1）進行詳細研究，用Omnic軟件用對蛋白質各二級結構進行定量分析。對應于二級結構的譜帶如下：1 650～1 670 cm-1對應于-螺旋，1 610～1 640 cm-1對應于-折疊，1 660～1 700 cm-1對應于-轉角，1 640～1 650 cm-1對應于無規則卷曲。每個二級結構組分的百分比通過相應峰的面積來計算[31]。蛋白質各二級結構進行定量分析結果如表2。

表2 低溫等離子處理時間對花生蛋白二級結構的影響

由表2可知，低溫等離子處理過程中，-折疊和無規則卷曲的含量先增加然后稍有降低，3 min時-折疊和無規則卷曲的質量分數達到最大，分別比對照樣品增加了2.98%和2.05%。蛋白質中的部分變性和高度分散性結構增加了其在油水界面的穩定性，因此經較短時間等離子處理使花生蛋白乳化性能提高，這與前面了乳化性和乳化穩定性的結果相一致。-螺旋的質量分數從28.95%（0 min）逐漸下降了7.86個百分點至21.09%（5 min）。-轉角的質量分數同樣從43.44%（0 min）逐漸下降了3.33個百分點至40.11%（5 min）。低溫等離子處理引發花生蛋白的二級結構的變化，其中-折疊和無規則卷曲的質量分數增加，而-螺旋和-轉角的質量分數降低，表明花生蛋白的有序結構被破壞，高能離子的轟擊使花生蛋白結構從有序和緊密變得無序和松散。

2.7 表面疏水性（HO）的測定結果

蛋白質表面疏水性是與極性水環境相關的蛋白質表面疏水基團數量的指標，ANS對環境變化極為敏感，對蛋白質分子的結構構象變化也非常敏感[32]，與其乳化性能密切相關。低溫等離子處理時間與花生蛋白表面疏水性的關系如圖7所示。由圖7可知，隨著低溫等離子處理花生蛋白時間的增加，表面疏水性呈現先稍有下降后逐漸升高的趨勢，3 min時H達到最大值703。花生蛋白的表面疏水性稍有降低可能是因為等離子處理初期在蛋白表面形成水膜有關。隨著等離子處理時間的增加，低溫等離子的持續放電，花生蛋白的表面結構被破壞，蛋白結構變得無序和松散，大量疏水基團被暴露，花生蛋白表面疏水性顯著提高。隨著處理時間的進一步增加，花生蛋白可能發生交聯反應，暴露了的疏水基團的數量減少導致花生蛋白的表面疏水性降低。該結果進一步證實了花生蛋白溶解度和乳化穩定性的結果。

圖7 低溫等離子處理時間對花生蛋白表面疏水性的影響

3 討 論

低溫等離子體產生的高能粒子通過能量傳遞，對蛋白表面進行轟擊，誘使蛋白的表面二級或高級結構被破壞，更多的活性位點被暴露，蛋白結構由緊密變松散，從而引起的功能性質的改善。等離子技術由于其操作簡便，處理時間短，副產物少，綠色、安全在食品工業應用尤其是蛋白改性方面會有廣闊的前景。由于在本試驗中我們設定了溶液的pH值為10.00，只對等離子改性前后花生蛋白的功能性質進行了分析，沒有與其它同類植物蛋白（如大豆蛋白）性質相對照分析。

4 結 論

低溫等離子技術處理對花生蛋白粉的溶解性、乳化性和乳化穩定性、起泡性和起泡穩定性、持水性和持油性有一定影響，具體結果為，在70 W處理功率下，低溫等離子放電時間為2 min時，溶解度和持水性達到最大，此時，花生蛋白溶解度為132.78 mg/L，持水性為1.93 g/g；放電時間為3 min時，花生蛋白的乳化性、乳化穩定性、起泡性、起泡穩定性和持油性也達到最佳。

在后續研究中，將繼續對等離子放電工藝參數進行優化，為低溫等離子在食品工業中應用提供技術支持；同時，在分子水平上探求等離子作用蛋白的機理，為低溫等離子改性蛋白應用提供理論參考。

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Effects of dielectric barrier discharge cold plasma treatment on solubility and water holding capacity of peanut protein

Ji Hui1,2, Yu Jiaojiao1, Zhang Jin1, Wei Rui1, Li Shuhong1, Chen Ye1※

(1.,,,300457; 2.,276002,)

The peanut protein, a protein-rich byproduct from oil extraction, contains 47%-55% high-quality protein, with low levels of anti-nutritional factors. It exhibits an excellent amino acid profile, a captivating aroma, and an exhilarating white color and is used as cholesterol-free commercial animal protein substitutes. However, its poor functional properties such as low solubility as well as emulsifying, foaming, and gel properties limit its applications. Therefore, improvement in the functional properties of peanut protein may be crucial to increase its application in food industry. Application of cold plasma (CP), a brand-new, nonhazardous and nonthermal, high technology with bright prospects, is currently attracting much attention. CP comprises ultraviolet photons, electrons, positive and negative ions, free radicals, and excited or non-excited molecules and atoms. In combination, these particles can break covalent bonds and initiate various chemical reactions. CP has been widely applied to clean, sterilize, and modify surfaces. Due to the advantages on broadness in frequency range, availability of the high-density non-equilibrium plasma in the larger space, simplicity in process, rapidity, efficiency, as well as other characteristics including energy-saving and environmental friendly, dielectric barrier discharge (DBD) cold plasma is considered to be the most popular plasma technology that can be applied in industry, thus becomes a major concern in the research field in modification of protein. Peanut protein solutions were modified by dielectric barrier discharge (DBD) cold plasma (CP) treatment. Effects of CP treatment on the structure and functional properties of peanut protein were evaluated by analysis of sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), Fourier transform infrared (FTIR) and protein surface hydrophobicity index (. A significant improvement in solubility and water holding capacity was found to be improved by CP, and reached a maximum value at 2 min treatment, solubility of peanut protein reaches 132.78 mg/L and water holding capacity of peanut protein is 1.93 g/g, increasing by 24.8% and 79.6% respectively compared with untreated samples. At the same time, emulsion ability, emulsion stability, foaming ability, foaming stability and oil absorbing capacity was all improved to some extent after CP treatment. The results showed that the molecular weight of peanut protein remained unaffected, meanwhile, an increase in thesheet and random coil content and a decrease in the-helix and-turn content was found, indicating that the structure of the protein changed from compact to loosen after CP treatment. The results of surface hydrophobicity indicated that CP treatment induced tertiary structural changes of the proteins,of peanut protein was increased remarkably. Our study results will further broaden the application of peanut protein in food industry such as dairy, meat products, and beverages. Furthermore, the operation was easy and the treatment time was short, which may make CP as a novel effective technology for protein modification.

proteins; plasma; structure; cold plasma; peanut protein; functional properties

季 慧，于嬌嬌，張 金，魏 瑞，李書紅，陳 野. 介質阻擋低溫等離子處理對花生蛋白持水性及溶解性的影響[J]. 農業工程學報，2019，35(4)：299－304. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2019.04.037 http://www.tcsae.org

Ji Hui, Yu Jiaojiao, Zhang Jin, Wei Rui, Li Shuhong, Chen Ye. Effects of dielectric barrier discharge cold plasma treatment on solubility and water holding capacity of peanut protein[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2019, 35(4): 299－304. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2019.04.037 http://www.tcsae.org

2018-10-15

2019-02-27

國家自然科學基金資助項目（31701526, 31501503）

季 慧，博士，講師，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白工程。Email：hji8002@126.com

陳 野，博士，教授，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白工程。Email：13752758201@126.com

10.11975/j.issn.1002-6819.2019.04.037

TS214.9

A

1002-6819(2019)-04-0299-06